原核生物的转录调控

1、关于原核生物的转录调控现在学习的是第一页，共85页转录的两个基本问题：1、蛋白质如何识别DNA的结合位点？2、转录的抑制或增强是如何进行的？ 现在学习的是第二页，共85页基因表达与转录调控基因表达与转录调控现在学习的是第三页，共85页重要的概念重要的概念1 1、反式作用因子和顺式作用元件反式作用因子和顺式作用元件2 2、结构基因和调控基因、结构基因和调控基因3 3、正调控和负调控、正调控和负调控4 4、单顺反子和多顺反子、单顺反子和多顺反子5 5、异构调控、异构调控现在学习的是第四页，共85页反式作用因子和顺式作用元件反式作用因子和顺式作用元件n基因的转录活性主要通过反式作用因子（trans-

2、acting factor）和顺式作用元件（cis-acting element）之间的特异相互作用来调节。 反式作用因子为蛋白质。例如：RNA聚合酶 顺式作用元件为DNA 。例如 ：启动子和终止子现在学习的是第五页，共85页反式作用和顺式作用的概念反式作用和顺式作用的概念n反式作用反式作用n顺式作用顺式作用现在学习的是第六页，共85页结构基因和调控基因结构基因和调控基因n结构基因（结构基因（structural gene）：编码）：编码RNA或蛋白质（包括结构或蛋白质（包括结构蛋白、酶和调控蛋白）的基因；蛋白、酶和调控蛋白）的基因；n调控基因（调控基因（regulator gene）: 编码

3、调控蛋白（编码调控蛋白（regulator protein）的基因，参与调控一个或多个结构基因表达。调控蛋白通过结合在的基因，参与调控一个或多个结构基因表达。调控蛋白通过结合在DNA的特定位点以调控其转录。的特定位点以调控其转录。 靶基因位点靶基因位点现在学习的是第七页，共85页调控蛋白调控蛋白激活蛋白（激活蛋白（activator）：增强转录）：增强转录阻遏蛋白（阻遏蛋白（repressor） ：抑制转录：抑制转录操纵基因，调控蛋操纵基因，调控蛋白的结合位点白的结合位点现在学习的是第八页，共85页9调控蛋白缺失调控蛋白缺失: : 基底转录基底转录负调控（负调控（negative regula

4、tion）：阻遏蛋白）：阻遏蛋白结合结合DNA 抑制基因表达抑制基因表达正调控（正调控（positive regulation）：激活蛋白）：激活蛋白结合结合DNA 增强基因表达增强基因表达正调控和负调控正调控和负调控现在学习的是第九页，共85页单顺反子单顺反子（monocistonic message）和多顺反子和多顺反子（polycistonic message）现在学习的是第十页，共85页异构调控异构调控 （allostery regulation)许多调控蛋白都是变构蛋白许多调控蛋白都是变构蛋白(allosteric protein)，通过与效应物结合改，通过与效应物结合改变构象而改变

5、活性，起到调节基因转录表达的作用，即异构调控变构象而改变活性，起到调节基因转录表达的作用，即异构调控 现在学习的是第十一页，共85页细菌基因表达调控策略：细菌基因表达调控策略：将功能相关的基因集合成组，这样易于整体调控。将功能相关的基因集合成组，这样易于整体调控。&相互临近、协同调控的一组基因的被称为操纵子（相互临近、协同调控的一组基因的被称为操纵子（operon）。）。如：如：lac操纵子操纵子&非临近但协同调控的一组基因的被称为调节子非临近但协同调控的一组基因的被称为调节子如：如：mal调节子调节子现在学习的是第十二页，共85页操纵子与乳糖操纵子操纵子与乳糖操纵子1.1.提出：提出：196

6、11961年年, , Jacob （雅格布）（雅格布）- -Monod（莫诺）（莫诺）. .2.2.操纵子操纵子( (operon) )：操纵子是原核生物基：操纵子是原核生物基因表达和调控的单元，典型的操纵子包因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：括：结构基因、调控元件和调节基因。结构基因、调控元件和调节基因。 大肠杆菌大肠杆菌K1212中共有中共有41364136个基因，以操纵个基因，以操纵子结构存在的基因接近子结构存在的基因接近1/4 1/4 （256 256 操纵操纵子，控制子，控制879879基因）基因）现在学习的是第十三页，共85页操纵子结构操纵子结构n结构基因：控制某一代谢途径关键

7、酶的多顺反子多顺反子。n调控元件：启动子和操纵区（覆盖在启动子和编码区交叉区，是阻遏调节蛋白质的结合位点）。n调节基因：独立编码蛋白质的基因。 调节基因的产物结合调控元件，抑制或激活结构基因的表达。现在学习的是第十四页，共85页乳糖操纵子乳糖操纵子The lacZ, lacY, lacA genes are transcribed into a single lacZYA mRNA () under the control of a single promoter Plac .操纵基因，又称操作子(operator)，为顺式调控元件，不编码任何产物！现在学习的是第十五页，共85页细菌生长特点细

8、菌生长特点n环境变化n营养供给n能量消耗最低化 当某种物质不存在时，细菌就不合成该物质代谢途径中的酶；而当该物质出现时，立即合成所需的代谢酶。这种当特定底物出现才合成特定酶的过程称为诱导当特定底物出现才合成特定酶的过程称为诱导（induction）。细菌能够快速做出应答，迅速从利用一种物质转变为另一种物质现在学习的是第十六页，共85页双峰生长双峰生长( (diauxic growth) )E. coli 生长在含有葡萄糖（glucose）和乳糖（lactose）的培养基上。细胞首先利用葡萄糖快速生长，直至葡萄糖耗尽。随后，细胞停止生长，“调整”以适应新的营养源乳糖。延滞期延滞期：约：约1小时小

9、时开启开启lac操纵子，积累操纵子，积累乳糖代谢所需要的酶乳糖代谢所需要的酶现在学习的是第十七页，共85页在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。 结果解读结果解读现在学习的是第十八页，共85页细菌开始乳糖代谢所需要的酶细菌开始乳糖代谢所需要的酶1、将乳糖转运至细胞内-半乳糖通透酶2、乳糖代谢：分解乳糖（二糖）分解为单糖b-半乳糖苷酶3、 -半

10、乳糖苷乙酰转移酶，作用不明。在有葡萄糖存在时，细菌体内的这三种酶含量很低。每个细胞中只有35个分子的半乳糖昔酶。当培养基中没有葡萄糖而有乳糖存在时，这三种酶的量急剧增加，23分钟内即可增加1000倍以上，而且三种酶成比例增加。一旦乳糖用完，在23分钟内这三种酶的量又很快下降到本底水平。现在学习的是第十九页，共85页启动子启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件调控元件结构基因结构基因 -半乳糖通透酶半乳糖通透酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶 调节基因调节基因操纵基因操纵基因转录方向转录方向转录单元转录单元lacZYAlacZYAPlacI启动

11、子启动子现在学习的是第二十页，共85页lacZ乳糖乳糖/半乳糖苷半乳糖苷半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖b-半乳糖苷键b-半乳糖苷酶异乳糖异乳糖b-b-半乳糖苷酶催化侧链反应使乳糖重排，形成异乳糖（诱导物）半乳糖苷酶催化侧链反应使乳糖重排，形成异乳糖（诱导物）现在学习的是第二十一页，共85页lacYlacA 现在学习的是第二十二页，共85页现在学习的是第二十三页，共85页启动子启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件调控元件结构基因结构基因 -半乳糖通透酶半乳糖通透酶分解乳糖分解乳糖半乳糖和葡萄糖半乳糖和葡萄糖运送乳糖透过细胞壁运送乳糖透过细胞壁乙酰辅酶乙酰辅酶A A 乙酰半乳糖

12、乙酰半乳糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷乙酰转移酶半乳糖苷乙酰转移酶 乳糖转化乳糖转化异乳糖异乳糖调节基因调节基因操纵基因操纵基因转录方向转录方向转录单元转录单元lacZYAlacZYAPlacI启动子启动子阻遏蛋白阻遏蛋白lacI（Lac repressor）现在学习的是第二十四页，共85页1、LacI可以结合DNA，其结合位点为operator（O）; 作用机制： LacI结合O位点，从而抑制RNA聚合酶和LacZYA基因启动子（PLac）的结合，从而阻止LacZYA mRNA的生成；2、LacI可以结合诱导物半乳糖，构象发生改变，不能结合operator, 从而对Lac操纵子的抑制消

13、失。现在学习的是第二十五页，共85页阻遏蛋白阻遏蛋白lacI单体具有单体具有DNA结合域（结合域（Helix-turn-helix，1-59位氨基酸位氨基酸）和诱）和诱导物结合域。导物结合域。阻遏蛋白阻遏蛋白lacI单体单体寡聚化寡聚化N末端末端C末端末端诱导物结合位点诱导物结合位点现在学习的是第二十六页，共85页阻遏蛋白阻遏蛋白lacI四聚体四聚体的组装的组装诱导物结合部位诱导物结合部位阻遏蛋白阻遏蛋白lacI由四个相由四个相同的单体亚基组成。同的单体亚基组成。现在学习的是第二十七页，共85页O1RNA polymerase: a2bb s s7070现在学习的是第二十八页，共85页TTGA

14、CATATAAT-35-35box-10-10boxs s70的一般识别位点的一般识别位点TTTACATATGTT-35-35box-10-10boxLac操纵子操纵子promoter:AAAdownup现在学习的是第二十九页，共85页Lac操纵子的操纵子的O1回文结构回文结构 现在学习的是第三十页，共85页In Jacob and Monads model, the lac operon contained a single operator (O1).However, two additional operators (O2 and O3) were subsequently discov

15、ered.In fact, there are three operators, the classical operator O1（major operator, 主操纵基因）, centered at position +11, the downstream auxiliary operator（辅助操纵基因） O2, centered at position +412, and upstream auxiliary operator O3, centered at 82.CAP is a positive regulator of the lac operon.现在学习的是第三十一页，共

16、85页四聚体四聚体LacI蛋白和蛋白和DNA的结合的结合1、四聚体、四聚体LacI蛋白的两个单蛋白的两个单体通过体通过DNA结合结构域与结合结构域与Lac操纵子的操纵子的O1区（中心位区（中心位于于+11）紧密结合，结合位点）紧密结合，结合位点为反向重复序列。为反向重复序列。 2、另一个二聚体的、另一个二聚体的DNA结结合结构域与合结构域与O2（中心位于（中心位于+412bp处）或处）或O3（中心位（中心位于于-82bp处）疏松结合，将处）疏松结合，将DNA拉成环状。拉成环状。 现在学习的是第三十二页，共85页现在学习的是第三十三页，共85页阻遏蛋白阻遏蛋白lacI与与DNA的结合是通过异构调

17、控来调的结合是通过异构调控来调节的节的 阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化：1、 阻遏物由两个二聚体组成四聚体；2、 二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续转角；3、 诱导物（异乳糖）结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头部不能同时和DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力现在学习的是第三十四页，共85页 诱导物改变LacI在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白：n随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍n诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上（并不形成游离蛋白

18、质）n除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上阻遏蛋白总是与阻遏蛋白总是与DNA结合在一结合在一起起 现在学习的是第三十五页，共85页问题乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（约为诱导时表达水平的约为诱导时表达水平的0.1%左右），这是由于左右），这是由于LacI与与O也偶尔解离，也偶尔解离，使细胞中有极低水平的使细胞中有极低水平的-半乳糖苷酶及半乳糖苷酶及-半乳糖通透酶生成。半乳糖通透酶生成。 现在学习的是第三十六页，共85页1、抑制子LacI负调控2、葡萄糖抑制Lac操纵子 葡萄糖的

19、存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻 3、CAP-cAMP复合物正调控Lac操纵子的调控因子操纵子的调控因子现在学习的是第三十七页，共85页异乳糖异乳糖诱导物诱导物乳糖乳糖重排重排-半乳糖苷酶半乳糖苷酶透性酶透性酶转乙酰酶转乙酰酶 RNA聚合酶聚合酶LacI单体LacI四聚体lacI介导的介导的lac操纵子基因操纵子基因表达的负调控机制表达的负调控机制现在学习的是第三十八页，共85页PEP,磷酸烯醇式磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸PEP提供磷酸基团，提供磷酸基团，Enzyme I (E1)直接被直接被PEP磷酸化，磷酸化的磷酸化，磷酸化

20、的E1将将它的磷酸基团转移到它的磷酸基团转移到HPr（磷酸载（磷酸载体蛋白体蛋白 ），磷酸化的），磷酸化的HPr是所有酶是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基团供）的磷酸基团供体：磷酸基团从体：磷酸基团从HPr转移到转移到EIIAGlc, 再到再到EIIB, 最终到达连接了葡萄糖的最终到达连接了葡萄糖的EIIC（有时会带上一个额外的链（有时会带上一个额外的链EIID），使葡萄糖发生磷酸化。），使葡萄糖发生磷酸化。 EIIAGlcEIIAGlcIIAGlc是葡萄糖专一的酶是葡萄糖专一的酶II，具有多种，具有多种调节的相互作用。它影响腺苷酸环调节的相互作用。它影响腺苷酸环化酶

21、、甘油激酶和非化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（通透酶（如：如：-半乳糖通透酶）的活性半乳糖通透酶）的活性 磷酸转移酶系统（磷酸转移酶系统（Phosphotransferase System，PTS）：单糖转运系统）：单糖转运系统现在学习的是第三十九页，共85页葡萄糖抑制葡萄糖抑制Lac操纵子的操纵子的分子机制分子机制-半乳糖通透酶半乳糖通透酶葡萄糖对葡萄糖对Lac操纵子的分解代谢阻遏操纵子的分解代谢阻遏(catabolic repression) ：IIAGlc由于葡萄糖转运而去磷酸化，导由于葡萄糖转运而去磷酸化，导致其结合致其结合-半乳糖通透酶，从而阻止半乳糖通透酶，从而阻止乳糖进入细胞。乳

22、糖进入细胞。 现在学习的是第四十页，共85页Lac操纵子操纵子的正调控因子的正调控因子功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活lac promoter，使，使RNA聚合酶结合并转录结构基因。聚合酶结合并转录结构基因。lac operon的正调控因子为一个复合体：的正调控因子为一个复合体：cAMP结合其受体结合其受体（cAMP receptor protein, CRP）。）。CRP又称为又称为“降解代谢物降解代谢物激活蛋白激活蛋白”（catabolite activator protein, CAP）环化环化AMPcAMP-CAP复合物正调控的操纵子：复合物正调控的

23、操纵子：lac, gal, ara等等现在学习的是第四十一页，共85页CAP对对cAMP介导的介导的b- -半乳糖苷酶的激活至半乳糖苷酶的激活至关重要关重要提取提取wild-type和和mutant的细胞提取的细胞提取物，分别加入不同量的物，分别加入不同量的cAMP进行体进行体外生产半乳糖苷酶；外生产半乳糖苷酶；过多的过多的cAMP间接抑制了半乳糖苷酶体外间接抑制了半乳糖苷酶体外表达的某些步骤表达的某些步骤现在学习的是第四十二页，共85页现在学习的是第四十三页，共85页 cAMP-CAP与与DNA相结合，造成双螺相结合，造成双螺旋弯曲，形成一个旋弯曲，形成一个“环状环状”结构，结构， lacI

24、无法与无法与O相结合，易于形成转录起始相结合，易于形成转录起始复合物，复合物，只要有这个只要有这个“环环”的亚基存在的亚基存在，lac operon就可以得到表达就可以得到表达。 cAMP-CAP还能直接和还能直接和RNA Pol相互相互作用，影响作用，影响RNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。现在学习的是第四十四页，共85页CAP-cAMP-DNA complex. Science 2002现在学习的是第四十五页，共85页Cell 1994CAP现在学习的是第四十六页，共85页cAMP/CAP的调控活性受的调控活性受AGlc蛋白的影响：蛋白的影响：AGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶，当葡

25、萄糖进入细胞时蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶，当葡萄糖进入细胞时AGlc蛋白发生去磷酸化，导致腺苷酸环化酶活性降低。蛋白发生去磷酸化，导致腺苷酸环化酶活性降低。因此，当环境中无葡萄糖时，细胞内因此，当环境中无葡萄糖时，细胞内cAMP含量升高。含量升高。腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶现在学习的是第四十七页，共85页有葡萄糖时，有葡萄糖时，cAMP浓度降低，浓度降低，lac操纵子表达下降。由于操纵子表达下降。由于Plac是弱启动是弱启动子，只因乳糖的存在而发生去阻遏而使子，只因乳糖的存在而发生去阻遏而使lac操纵子开放表达水平很低；操纵子开放表达水平很低；有有cAMP-CAP加强转录活性，细菌才能合

26、成足够的酶来利用乳糖。加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。cAMP-CAP对对lac等操纵子具有强的正调控，能克服操纵子的代谢物阻遏等操纵子具有强的正调控，能克服操纵子的代谢物阻遏效应。效应。 现在学习的是第四十八页，共85页lac操纵子的强诱导条操纵子的强诱导条件：件：既要有乳糖又要无葡萄既要有乳糖又要无葡萄糖糖葡萄糖（葡萄糖（+）；乳糖（）；乳糖（-）：不诱导）：不诱导葡萄糖（葡萄糖（+）；乳糖（）；乳糖（+）：低诱导）：低诱导葡萄糖（葡萄糖（-）；乳糖（）；乳糖（+）：高诱导）：高诱导现在学习的是第四十九页，共85页1 1、当当lacI封闭转录时，封闭转录时，CAP对对Lac操

27、纵子表达系统不能发挥操纵子表达系统不能发挥作用；作用；2、如无、如无CAP加强转录，即使没有加强转录，即使没有lacI与操纵序列结合，操与操纵序列结合，操纵子的转录活性很低。纵子的转录活性很低。3、若有葡萄糖或葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌首先利若有葡萄糖或葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对用葡萄糖。葡萄糖对 Lac操纵子操纵子的阻遏作用机制为分解代的阻遏作用机制为分解代谢阻遏。谢阻遏。4、 Lac操纵子操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。现在学习的是第五十页，共85页“来得快，去得快来得快，去得快”mRNA合成，合成， 对诱导反应迅速

28、对诱导反应迅速现在学习的是第五十一页，共85页-半乳糖苷酶稳定性半乳糖苷酶稳定性很强很强现在学习的是第五十二页，共85页操纵子的突变操纵子的突变n不可诱导型突变（uninducible mutation） 使操纵子在任何情况下都不能表达n组成型突变（consititutive mutation ） 使操纵子不受调控物的影响而持续性表达。现在学习的是第五十三页，共85页lacI基因突变导致操纵子持续性表达组成型突变突变的lacI基因产物不能结合DNA 现在学习的是第五十四页，共85页异乳糖异乳糖诱导物诱导物乳糖乳糖重排重排-半乳糖苷酶半乳糖苷酶透性酶透性酶转乙酰酶转乙酰酶 合成诱导物合成诱导物：

29、IPTGRNA聚合酶聚合酶现在学习的是第五十五页，共85页一些乳糖类似物不能被一些乳糖类似物不能被-半乳糖苷酶分解，却也能与半乳糖苷酶分解，却也能与LacI特异性结合而使其构象改变特异性结合而使其构象改变，诱导，诱导Lac操纵子的开放。操纵子的开放。如异丙基硫代半乳糖苷如异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)是很强的非代谢性诱导剂是很强的非代谢性诱导剂，能够结合，能够结合lacI，且性质稳定，不被细胞降解；，且性质稳定，不被细胞降解；X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-半乳糖苷）半乳糖苷）也是一种人工合成的半乳糖苷，可被也是一种人工合成的

30、半乳糖苷，可被-半乳糖苷酶水解产生蓝色化合物，因此可以用半乳糖苷酶水解产生蓝色化合物，因此可以用作作-半乳糖苷酶活性的指示剂。半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和和X-gal被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中。现在学习的是第五十六页，共85页Lac操纵子的应用操纵子的应用1、蓝白斑筛选2、IPTG体外诱导蛋白质表达现在学习的是第五十七页，共85页 蓝白斑筛选蓝白斑筛选原理：-半乳糖苷酶可分成2部分即肽段（N-端的146个aa）和C-段。肽段的基因位于载体上并含有多克隆位点，而C-段的基因通过基因工程技术插入E. coli基因组。二者在同一菌株中表达时，菌

31、株中的C-段与载体上的肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变肽段的ORF而使得载体上的肽段不能与菌株中的C-段互补而不能切割无色化合物X-gal，从而产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。 现在学习的是第五十八页，共85页IPTG体外诱导蛋白质表达体外诱导蛋白质表达表达T7 RNA polymerase溶原性噬菌体（如：溶原性噬菌体（如：DE3）在感染）在感染于寄主细菌时，不使细菌裂解，而于寄主细菌时，不使细菌裂解，而成为与细胞同步增殖的遗传因子成为与细胞同步增殖的遗传因子前噬菌体。前噬菌体通常在寄前噬菌体。前噬

32、菌体通常在寄主细菌细胞中的每个染色体上有主细菌细胞中的每个染色体上有1个，细菌分裂时前噬菌体也分裂并分个，细菌分裂时前噬菌体也分裂并分配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。 具有前噬菌体具有前噬菌体的细菌称为溶原性细菌。的细菌称为溶原性细菌。D现在学习的是第五十九页，共85页原核表达宿主菌的选择nBL21（DE3）：为DE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5启动子(不受cAMP-CAP调控)控制的T7 RNA聚合酶基因。 npLysS 和 pLysE 宿主菌带有编码T7溶菌酶（为T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE宿主

33、菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。 nRosetta（DE3）：Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。现在学习的是第六十页，共85页常用的表达载体常用的表达载体npET系列系列npGEX系列系列现在学习的是第六十一页，共85页现在学习的是第六十二页，共85页现

34、在学习的是第六十三页，共85页 阿拉伯糖操纵子（ The ara operon ）：q参与阿拉伯糖代谢酶的基因分布于3个操纵子中：1、araBAD:编码3个阿拉伯糖代谢相关酶，1）核酮糖激酶(ribulokinase)、2）L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)，3）L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。2、araE 3、araFGH编码膜结合蛋白，参与阿拉伯糖的结合和转运现在学习的是第六十四页，共85页核酮糖激酶核酮糖激酶L-阿拉伯糖阿拉伯糖异构酶异构酶L-核酮糖核酮糖-5-磷酸磷酸-4-差向异构

35、酶差向异构酶FEMS Microbiol Rev (2010) 118现在学习的是第六十五页，共85页q三个操纵子由一个调节基因（araC）的产物C蛋白调控：n1、araC表达受到AraC的自我调控。n2、araC既可充当阻遏物(不结合阿拉伯糖)，也可作为激活剂(结合阿拉伯糖) 。n3、araC与CAP可充分诱导ara操纵子。n4、araC蛋白在阿拉伯糖操纵子上有3个不同结合部位: ara I、araO1和araO2现在学习的是第六十六页，共85页没有没有C蛋白时，转录蛋白时，转录C mRNA，表，表达一定水平的达一定水平的C蛋白蛋白负调控负调控正调控正调控cAMP-CAP结合了结合了Ara的

36、的C二聚体二聚体araBAD和和araC的起始转录需要的起始转录需要cAMP-CAP，因此葡，因此葡萄糖存在时萄糖存在时araBAD和和araC操纵子均关闭。操纵子均关闭。 C蛋白二蛋白二聚体聚体当当Ara存在而无葡萄糖时，存在而无葡萄糖时，Ara与与AraC蛋白结合使其构象改变而释放蛋白结合使其构象改变而释放araO2，不再成环，不再成环，此时，此时Ara-AraC结合在结合在araI1，araI2和和araO1处。同时由于处。同时由于cAMP的积累激活的积累激活CAP，活，活化的化的CAP结合在位于结合在位于araO1和和araI间的间的CAP位点。位点。araBAD表达，表达， Ara-

37、araC在在araO1处结处结合使合使araC不能表达。即：不能表达。即： araC+Ara和和CAP共同作用可激活共同作用可激活araBAD转录转录当当cAMP水平较低且缺乏阿拉伯糖时，水平较低且缺乏阿拉伯糖时，AraC二聚体结合在二聚体结合在araO2和和araI1半位点使半位点使DNA成环，阻遏成环，阻遏araBAD的表达。的表达。现在学习的是第六十七页，共85页 当同时有葡萄糖和阿拉伯糖时，低水平的当同时有葡萄糖和阿拉伯糖时，低水平的cAMP-CAP不能不能起始起始araBAD和和araC转录转录，因此，因此araBAD和和araC都不表达都不表达。现在学习的是第六十八页，共85页当当

38、AraC水平较低时，其基因从水平较低时，其基因从Pc开始表达。当开始表达。当AraC蛋白浓度高时，由蛋白浓度高时，由于于AraC与与AraO1结合，而结合，而araO1与与AraC基因的启动子重叠，可阻遏基因的启动子重叠，可阻遏araC基因的表达。基因的表达。 AraC的自我调控现在学习的是第六十九页，共85页色氨酸操纵子色氨酸操纵子(tryptophane operon, trp operon) 色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因为多顺反子，即trpE、trpGD（G和D基因融合）、trpCF （C和F基因融合） 、trpB、trpA。其中，E和G编码邻氨基苯甲酸

39、合成酶； D编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶； F编码邻氨基苯甲酸异构酶、A和B编码色氨酸合成酶；C编码吲哚甘油-3-磷酶合成酶。 色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖和不受葡萄糖和cAMP-CAP的调控的调控。 现在学习的是第七十页，共85页色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的结构 1、trpR和和trpABCDE不紧密连锁，距离很远；不紧密连锁，距离很远； 2、 操纵基因（操纵基因（O）在

40、启动子（）在启动子（P）内）内 3、有弱化子、有弱化子(attenuator) 4、启动子和结构基因不直接相连，、启动子和结构基因不直接相连， 二者被前导序列二者被前导序列(Leader)所隔开所隔开 现在学习的是第七十一页，共85页PO现在学习的是第七十二页，共85页The trp operon的调控的调控n阻遏调控阻遏调控 色氨酸发挥co-repressor的作用 阻遏调控抑制转录70倍n弱化作用弱化作用 翻译影响转录（只存在原核生物） 弱化作用抑制转录10倍现在学习的是第七十三页，共85页当色氨酸缺乏时，调节基因（当色氨酸缺乏时，调节基因（trpR）编码）编码无活性的无活性的为辅阻遏蛋白

41、为辅阻遏蛋白aporepressor当细胞中色氨酸浓度较高时，色氨酸和当细胞中色氨酸浓度较高时，色氨酸和aporepressor结合，形成有活性的结合，形成有活性的色氨酸操纵子阻遏蛋白色氨酸操纵子阻遏蛋白aporepressor阻遏调控阻遏调控现在学习的是第七十四页，共85页高高Trp时：时：辅阻遏物蛋白辅阻遏物蛋白+Trp 结合操结合操纵基因纵基因 不转录不转录低低Trp时：时：辅阻遏物蛋白辅阻遏物蛋白 不结合操不结合操纵基因纵基因 转录转录现在学习的是第七十五页，共85页前导区（前导区（leader）：结构基因起始密码子前有）：结构基因起始密码子前有162个碱基，构成前导区。个碱基，构成前导区。1、前导肽（、前导肽（leader peptide）：前导区）：前导区mRNA可编码可编码14个氨基酸组成的多肽，其中第个氨基酸组成的多肽，其中第10和第和第11位均为色氨酸。色氨酸存在时，前导肽依然会合成。位均为色氨酸。色氨酸存在时，前导肽依然会合成。2、有四个富含、有四个富含GC的区段（的区段（14），）， 4区段后为