土壤中分解尿素的细菌的分离与计数2课时

1、二二. .实验的具体操作实验的具体操作 . .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。. .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。将称好的土样倒入盛有。将称好的土样倒入盛有90mL90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

2、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计数的平板。之间、适于计数的平板。细菌稀释度为细菌稀释度为10104 4、10105 5、10106 6，放线菌稀释度为，放线菌稀释度为10103 3、10104 4、10105 5，真菌稀释度，真菌稀释度为为10102 2、10103 3、10104 4。P24P24旁栏思考题：旁栏

3、思考题： 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？吗？答：答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株株/kg/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为21852185万，万，放线菌数约为放线菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。因万。因此

4、，为获得不同类型的微生物，就需要按不同此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。供选择培养的条件。实验时实验时要对培养要对培养皿作好标皿作好标记。注明记。注明培养基类培养基类型、培养型、培养时间、稀时间、稀释度、培释度、培养物等。养物等。 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。为了提高效率，在操作时更加有

5、条不紊，应为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。当事先规划时间。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在细菌一般在30303737培养培养1 12d2d，放线菌一般在，放线菌一般在25252828培养培养5 57d7d，霉菌一般在，霉菌一般在25252828的温的温度下培养度下培养3 34d4d。思考与讨论思考与讨论在微生物培养过程中，为什么每隔在微生物培养过程中，为什么每隔24h24h统计一统计一次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？答：答：不同种类的微生物，往往需不同的培养温不同种类的微生物，往往需不

6、同的培养温度和培养时间，每隔度和培养时间，每隔24h24h统计统计1 1次菌落数目，选次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。四、实验过程四、实验过程 （一）土壤取样（一）土壤取样 1 1、天然培养基和合成培养基：、天然培养基

7、和合成培养基： 2 2、土壤取样：、土壤取样： （1 1）取样的位置：）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤是细菌。在富含有机质的土壤层的层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。 （2 2）取样要求：铲去表层土。）取样要求：铲去表层土。 菌落计数菌落计数配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养（二）样品稀释（二）样品稀释 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2

8、2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。（三）微生物的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放线菌放线菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.

9、4d. 3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定稳定菌落菌落”为观察对象为观察对象 （四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物鉴别培养基：不影响微生物的生存的生存 酚红培养基：酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种

10、一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状，与其他微生物加以区表现某微生物的特定性状，与其他微生物加以区别别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄

11、糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤