质粒种类与应用

1、克隆载体polylinker载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与

2、特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNA型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNA质粒质粒DNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 300 kb质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质

3、粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝拷贝 stringent plasmid质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自

4、主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向复制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNA复制启动控制复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复

5、制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容性的质，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成粒组成不相容性群不相容性群质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相

6、容性：分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优

7、势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等质粒等如如Col、R的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发

8、生的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由 bom 和和mob 基因决定基因决定20060421质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有

9、重要意义重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：建的：pSC101 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.

10、5 kb 拷贝数拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 Apr质粒质粒质粒的分类质粒的分类人工人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝高拷贝质粒质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝低拷贝质粒质粒 来自来自pSC101 拷贝数小于拷贝数小于10 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏温敏质粒质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数

11、、整合等不同性质测序测序质粒质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合整合质粒质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭穿梭质粒质粒 装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆便于基因克隆表达表达质粒质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针探针质粒质粒 装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR32

12、24363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆用于基因克隆 pBR322AmpTet重组 DNAAmprTcs提 取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转 化 无 菌落阳 性菌 落筛 选重 组 子2)DNA重组无 DNA插入有 DNA插入外 源DNA1)限制 酶 切EcoSacKpnSmaBamXbaSalP

13、stSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCT

14、GCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记正选择标记 lacZ 的显色原理的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-b b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子

15、装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7和和SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNA编码的编码的RNA聚合聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等等 AmN2HlacZEcoRIHindIIIOriOri复制起点复制起点LacZAPRpUC19质粒质粒质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化实验室实验室一般使用下列

16、三种方法制备质粒一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法碱溶法 质粒质粒DNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法 质粒质粒DNA纯度、操作周期介于纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间氯化铯法和碱溶法之间质粒质粒质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 用含有用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加CsCl和和溴乙锭溴乙锭超速离心过夜超速离

17、心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒质粒质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化碱溶法：碱溶法： 用含有用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加NaOH和和SDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体DNA及大部分蛋白质及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇

18、沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无用无DNase的的RNase去除残余的去除残余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA质粒质粒质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有EDTA和和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴40秒钟秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异

19、性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工能被开发成为基因工程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬

20、菌体噬菌体DNAl l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA组组成成 l l-DNA全长全长48502个核苷酸个核苷酸l l-DNA上上至少有至少有61个基因个基因l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻

21、遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l - DNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期E.coli吸附吸附LamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染周期感染周期体内包装体内包装100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kbDA包装范围为原包装范围

22、为原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kb噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 溶原状态溶原状态 l l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为菌体颗粒，这种情况为溶原状态溶原状态。整合主要由。整合主要由l l-DNA上的上的cI和和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于两基因的产物所激活，而这两个基

23、因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l l-DNA或宿主细或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态溶原状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态 DNA重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分n 左臂：从左臂：从A到到J长约长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。n中段：长约中段：长约20kb

24、，是，是DNA整合和切出，溶原生长所需的整合和切出，溶原生长所需的序列。序列。n右臂：长约右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左复制起始均在这区域内。左右臂包含右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。需的。 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载

25、体的构建：缩短长度缩短长度 野生型野生型l l-DNA包装的上限为包装的上限为51kb，本身长度为本身长度为48.5kb，只有只有当插入的外源当插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb时时，才能被包装成有感染，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l l-DNA的长度的长度，可以提高装，可以提高装载量。其实野生型载量。其实野生型l l-DNA上约有上约有40-50%的片段是复制和裂解的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将l l-DNA分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体取代型载体取代型载

26、体 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 插入型载体插入型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 kb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 取代型载体（置换型载体）取代型载体（置换型载体）体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 kb（51 26）载体长度载

27、体长度 26 kb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 kb（36 26）n允许外源允许外源 DNA 片段替换非必须片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为片段的载体，称为置换型载体（置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载，故而该载体主要用来构建基因组文库。体主要用来构建基因组文库。 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型

28、的l l-DNA链上有链上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点，位点，不不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 2个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点位点噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型l l-DNA上缺少合适

29、的选择标记，因此上缺少合适的选择标记，因此加装加装选择标记是选择标记是l l-DNA克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容l l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记 imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止l l-噬菌体噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的基因的l l-载体进入受体细胞后，建立

30、溶载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源当外源DNA插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭活，活， l l-重组分子便进入溶菌循环，形成重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记 lacZlacZ基因编码基因编码b b-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基因插入到因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，

31、不能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体l l-DNA则产则产生蓝色透明斑生蓝色透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的构建：载体的构建：构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（琥珀型突变（sup) )是指由是指由CAG（Gln）向向UAG（stop）的突变。的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。将野生型将野生型l l-DNA上上D和和E两个头部包装蛋白的基因中的两个头

32、部包装蛋白的基因中的CAG密码密码子突变成子突变成UAG。当这种当这种l l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA载体的主要类型：载体的主要类型：插入灭活型载体插入灭活型载体C

33、haron2、Charon6、l lgt11取代型载体取代型载体l lEMBL4、l lgtl lc、l lNM762、Charon40正选择型载体正选择型载体l lEMBL1、l lL47、l l1059野生型的野生型的l l噬菌体不能在噬菌体不能在P2噬菌体溶源性噬菌体溶源性的细菌中繁殖（的细菌中繁殖（Spi+），），这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受l l-DNA上的上的red和和gam两个基因控制。若将外两个基因控制。若将外源源DNA取代取代red和和gam，重组重组噬菌体便拥有噬菌体便拥有Spi-表型，能在表型，能在P2噬菌噬菌体体溶源性溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑的

34、大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：l l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l l噬菌体的大肠杆菌中提噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少一部分缺少E组份，另一部分则缺少组份，另一部

35、分则缺少D组份。包装时，当且仅当组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组这两部分包装蛋白与重组l l-DNA分子混合后，包装才能有效进分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组行，任何一种蛋白包装液被重组l l-DNA污染后，均不能被包装污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长

36、期 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，37培养培养1小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l-DNA 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNAl l-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：l l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能

37、高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l l-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量 重组重组l l-DNA分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组l l-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便 l l-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达片段，但不适合表达 外源基因外源基因n表达载体表达载体 pET-5a 是典型的是典型的 pET 载体，其组成是在载体的载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的噬菌体启动子序列及

38、其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。在特定的宿主细胞中诱导表达。 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNA组成组成 M13 DNA全长全长6407个核苷酸个核苷酸M13 DNA上上至少有至少有10个基因个基因2700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子M13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制

39、其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 nM13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13 噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链 DNA ，由，由 6407 的碱基组成的碱基组成 （GenBank 注册号为注册号为 V00604） 。基因组。基因组 90% 以上的序列可编以上的序列可编码蛋白质，共有码蛋白质，共有 11 个编码基因个编码基因，基因之间的间隔区多为几个，基因

40、之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因碱基。较大的间隔位于基因 和基因和基因 以及基因以及基因 和基因和基因 之间，其间有调节基因表达之间，其间有调节基因表达和和 DNA 合成的元件。合成的元件。M13 噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码 3 类类蛋白质，包括复制蛋白（基因蛋白质，包括复制蛋白（基因 ， 和和 ），形态发生蛋白），形态发生蛋白（基因（基因， 和和 ），结构蛋），结构蛋白（基因白（基因 、 和和 ）。基因组）。基因组 DNA 为正链，按为正链，按基因基因 至基因至基因 方向合成，方向合成，与噬菌体的与噬菌体的 mRNA 序列同义。序列同义。 nM13 噬菌体颗粒为丝状长管

41、噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长状结构，长 880nm ，直径，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心。噬菌体颗粒的核心由由 2700 个基因个基因 编码的结编码的结构蛋白呈管状排列而成，成构蛋白呈管状排列而成，成熟的基因熟的基因 的产物为由的产物为由 50 个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的 螺旋螺旋蛋白。顶端由蛋白。顶端由 5 个基因个基因 和和 5 个基因个基因 产物组成，作用产物组成，作用于间隔区中的包装信号。于间隔区中的包装信号。 5 个基因个基因 蛋白和蛋白和 5 个基因个基因 蛋白位于丝杆的末端，参蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。右图是与对性纤毛的吸咐。右图是 M13 噬菌

42、体结构模型。噬菌体结构模型。噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染周期感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通过 复制方式， RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止

43、子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。 n单链单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13 DNA载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII

44、野生型野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体系列载体lacZpolylinker噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNAM13 DNA载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在这在DNA定向突变中非常有用定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便重组分子筛选简便被被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越

45、大，混浊斑的混浊度亦越大斑的混浊度亦越大 但但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链单链DNA病毒病毒双链双链DNA病毒病毒单链单链RNA病毒病毒双链双链RNA病毒病毒 RNA病毒在自我复制

46、时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组重组。考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒 l l-DNA载体和载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25 kb和和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNA片段，片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌

47、体DNA的长度，的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。n

48、粘粒（粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序序列的质粒。列的质粒。 cos 序列是序列是 l l 噬菌体噬菌体 DNA 中将中将 DNA 包装到包装到噬菌体颗粒中所需的噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。序列。n粘粒的组成包括质粒复制起点（粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（），抗性标记（ampr），）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆，克隆的最大的最大 DNA 片段可达片段可达 45kb 。有

49、的粘粒载体含有两个。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。位点，在某种程度上可提高使用效率。考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有1978年年Collins和和Hohn发明构建发明构建pHC796400 bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl l-DNA cos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体cos site - carrying plasmid1.8 kb的的l l-DN

50、A片段片段 + pBR322片段片段装载范围为装载范围为31 - 45 kb考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像l l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or

51、 phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子包装序列、复制子以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的装载量比常规的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易通过克隆双链通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度

52、的单一单链DNA考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13间隔区间隔区 IGpUC119 pUC19 + M13间隔区间隔区 IG500 个拷贝个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示表示M13辅助噬菌体辅助噬菌体DNA考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体体外转录载体pBlues

53、cript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子噬菌体启动子PT3和和PT7强化外强化外源基因的转录源基因的转录提取出来的单链提取出来的单链DNA重组分重组分子子在噬菌体在噬菌体RNA聚合酶的存聚合酶的存在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因的体外转录的体外转录n人们设计出一些多功能的质粒载体，这人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、类质粒载体有多克隆位点、 -互补、互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。装信号。

54、n典型的这类质粒有典型的这类质粒有 pBluescriptKS（），这类质粒一般由），这类质粒一般由 4 个质粒组成一个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端反（根据多克隆位点两端 Kpn 和和 Sac 的顺序，用的顺序，用 KS 或或 SK 表示），表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导者说，引导 DNA 双链中不同链合成单双链中不同链合成单链链 DNA ，用，用 + 或或 - 表示）。表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位点的多克隆位点与与 pUC18/19 的不同，

55、且使用的不同，且使用 f1 噬菌噬菌体的复制与包装信号序列体的复制与包装信号序列 。 人造染色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千 kb 的的DNA片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源DNA克隆在这些染

56、色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YAC）人造染色体载体人造染色体载体细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上质粒的基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量

57、范围在50 - 300 kb之间之间各种类型的各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库F 质粒质粒n大肠杆菌的大肠杆菌的 F 因子是一个约因子是一个约 100kb 的质粒。它编码的质粒。它编码60多多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。）。n虽然虽然F因子通常以双链闭环因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝个拷贝/细胞）的形细胞

58、）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处个位点处进行随机整合（进行随机整合（Low，1987）。）。n携带携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的发样状的F菌毛。菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。触所必需。n细菌人工染色体是基于大肠杆菌的细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。量低拷贝的质粒载体。n每个环状每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来分子中携带一个抗生素抗性标

59、记，一个来源于大肠杆菌源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制因子（致育因子）的严谨型控制的复制子子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于），一个易于 DNA 复制复制的由的由 ATP 驱动的解旋酶（驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和和 parC ） 。 nBAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。20

60、060424真核生物载体真核生物载体n电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。促使细胞发生融合的目的。n该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。物克隆等。 显微注射技术将外源显微注射技术将外源DNA注入细胞注入细胞基因枪技术基因枪技术n是一种将核酸直接发送至细胞内是一种将核酸直接发送至细