【课件】3.2基因工程的基本操作程序（第1课时）（课件）（人教版2019选择性必修3）

1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步主要包括哪几个步骤？骤？基因工程操作的每一步涉及的技术和方基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？法有哪些？121997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？【从社会中来从社会中来】转基因抗虫棉与普通棉花转基因抗虫棉与普通棉花 提示：苏云金杆菌通过产生提示：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（伴孢晶体蛋白（BtBt抗虫蛋白）抗虫蛋白），破坏鳞翅目，破坏鳞翅目昆

2、虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生转到棉花里，让棉花也能产生BtBt抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。苏云金杆菌苏云金杆菌与载体与载体拼接拼接 普通棉花普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性） 棉花棉花细胞细胞抗虫棉抗虫棉提取提取表达表达Bt基因基因导入导入Bt基因基因重组重组DNA分子分子培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程【从社会中来从社会中来】DNA片段基因1 基因2 基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子原核基因终止子编码区非编码区非编码区内含子 启动子编码

3、区上游 编码区下游 真核基因知识补充非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码出蛋白质的DNA序列。非编码区：不编码蛋白质,含有能调控遗传信息表达的DNA序列(如启动子、终止子）。原核细胞的基因结构：原核基因（连续的）编码区非编码区非编码区内含子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 真核基因编码区非编码区：能转录相应的能转录相应的mRNA，进一步，进一步能编码蛋能编码蛋白质的白质的DNA序列序列能转录相应的能转录相应的mRNA，然后，然后在翻译前就在翻译前就被剪切掉被剪切掉，不能编码蛋白质的不能编码蛋白质的DNA序列序列不编码蛋白质，含有

4、不编码蛋白质，含有能能调控遗传信息表达调控遗传信息表达的的DNA序列，包括启动子、终止子等。序列，包括启动子、终止子等。外显子：外显子：内含子：真核细胞的基因结构：（不连续）非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子编码区非编码区非编码区内含子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 原核基因真核基因RNARNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录聚合酶识别并结合的位点，驱动转录启动子终止子本质：本质：位置：位置：作用：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；本质：本质：位置：位置：作用：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录 基因工程的一般操作程序主

5、要包括四个步骤：基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定。1.目的基因的筛选与获取4.目的基因的检测与鉴定2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序定义定义：在基因工程的设计和操作中，用于：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状改变受体细胞性状或或获得预获得预期表达产物期表达产物等等相关相关的基因。的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。根据不同的

6、需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。相关的基因。资料：资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将科学家将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中，棉花产生转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因目的基因1.1.目的基因目的基因 01从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选从相关的已

7、知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因目的基因 科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解 利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因问题问题：筛选出来的目的基因如何获取？ 012.2.筛选合适的目的基因筛选合适的目的基因PCR基因文库包括生物材料获取目的基因DNAcDNA一定大小范围的DNAmRNA 基因组文库 cDNA文库限制酶酶切逆转录导入受体菌中保存 013.3.从生物材料获取从生物材料获取目的基因的方法目的基因的方法基因组文库基因组文库部分基因文库（主要是部分基因文库（主要是）基因文库：基因文库：基因基因组组文库文库：含有某

8、种生物含有某种生物全部基因全部基因片段的重组片段的重组DNA的的克隆群体克隆群体。从基因文库中直接获取从基因文库中直接获取部分部分基因文库基因文库：含有某种生物含有某种生物部分基因部分基因片段的重组片段的重组DNA的的克隆群体克隆群体。 013.3.从生物材料获取目的基因的方法从生物材料获取目的基因的方法基因组文库从细胞中提取DNA细胞基因组DNA质粒质粒酶切DNA连接酶连接限制酶酶切导入细菌中基因组文库克隆提取酶切的DNA片段cDNA文库逆转录逆转录酶酶切的cDNA片段限制酶酶切质粒质粒酶切连接导入细菌中cDNA文库克隆提取基因组DNA限制酶酶切mRNA逆转录得cDNA拼接质粒，导入细菌中保

9、存为文库基因组文库cDNA文库选择含有目的基因的克隆，用构建文库时的限制酶切割获得目的基因获取目的基因的方法有多种，现在，常用获取目的基因的方法有多种，现在，常用PCRPCR特异性地快速扩增目的基因特异性地快速扩增目的基因 发明者：穆里斯； PCR是聚合酶链式反应聚合酶链式反应的缩写； PCR的原理：依据半保留复制，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定 013.3.从生物材料获取目的基因的方法从生物材料获取目的基因的方法35DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的

10、3-端，即子链的延伸方向是5 3 。由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物子链合成需要引物（最初的已有链）。DNA聚合酶35模板链体内体内DNA复制参与的组分复制参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用PCR中参与的组分中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸说明说明：PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA母链4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚

11、合酶引物（通常为小的单链DNA）目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定反应还需要其它条件，如缓冲液等4.4.利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因（获取和扩增目的基因（DNADNA复制所需的基本条件复制所需的基本条件）条件4.4.利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因（获取和扩增目的基因（PCRPCR扩增的过程扩增的过程）5 33 5 3 5 5 35 3引物13 5 引物23 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物1目的基因目的基因条件：条件：DNADNA模板、模板、4 4种脱氧核苷酸、引物和种脱氧核苷

12、酸、引物和TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶过程：过程：变性变性延伸延伸退火退火4.4.利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因（获取和扩增目的基因（PCRPCR扩增的过程演示扩增的过程演示）3 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物13 5 5 3引物15 3引物13 5 引物25 3引物13 5 引物25 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物25 33 5 引物25 3引物13 5 引物2受热变性受热变性引物引物 耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(1)过程：过程：（2）结果：）结果：1个模板个模板D

13、NA分子经过分子经过n轮轮PCR，以以_方式扩增，方式扩增，可可以扩增出以扩增出 个个DNA片段。片段。指数指数2n 01PCRPCR小结小结基因工程的基因工程的核心核心是基因表达载体的构建，其目的是是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。同时使目的基因。同时使目的基因能够表达和发挥作用。能够表达和发挥作用。 一个基因表达载体的组成，除了一个基因表达载体的组成，除了有有目的基因目的基因外，还必须有外，还必须有启动子、终启动子、终止子、标记基因止子、标记基因等。等。 021.1.目的目的2.2.基因表

14、达载体的组成基因表达载体的组成标记基因的作用标记基因的作用：用于：用于鉴别受体细胞中是鉴别受体细胞中是否含有目的基因否含有目的基因，从而将含有目的基因的细，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。标记基因。启动子启动子：启动子是一段有特殊序列结构的：启动子是一段有特殊序列结构的DNADNA片段，位于基因的片段，位于基因的上游上游，紧挨转录的起始位点，它紧挨转录的起始位点，它是是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才能，有了它才能够驱动基因转录出够驱动基因转录出mRNAmRNA，最终表达出人类所需的蛋

15、白质。，最终表达出人类所需的蛋白质。终止子终止子：位于基因的：位于基因的下游下游，也是一段有特，也是一段有特殊序列结构的殊序列结构的DNADNA片段，片段，是转录过程终止的信是转录过程终止的信号号。2.2.基因表达载体的组成基因表达载体的组成pBI121载体多克隆位点是目的基因插入部位，一般具有多种限制酶的酶切位点RNA聚合酶识别位点，启动转录。具有物种和组织细胞特异性负责将其间序列插入至染色体DNA抗卡那霉素基因，用于重组体的筛选T-DNAT-DNA转录终止信号目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因限制酶切割位点 先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶限制酶DNA连接酶目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定3.3.基因表达载体的构建程序基因表达载体的构建程序BamH Hind Xba Sma Hind