第十六章色谱法分离原理

1、第十六章 色谱法分离原理 第一节第一节 概述概述 色谱法是一种重要的分离分析色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的。能力不同而达到分离目的。1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952 James和Martin发展了气相色谱；1956 Van Deemter提出速率理论；1967 Kirkland等研制高效液相色谱法； 20世纪世纪80年代以后年代以后出现毛细管电泳和毛细管出现毛细管电泳和毛细管 电动色谱等一系列新的色谱分析方法。电动色谱等一系列新的色谱分析方法。1903 俄国植物学家茨维特分离植物色素俄国

2、植物学家茨维特分离植物色素t s o在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）管内静止不动的一相（固体或液体）称为称为固定相固定相 ；o自上而下运动的一相（一般是气体或自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为液体）称为流动相流动相 ；o装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为管）称为色谱柱色谱柱 。o当流动相中样品混合物经过固定相时，当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、

3、强弱也有差异，互作用的类型、强弱也有差异，因此因此在同一推动力的作用下，不同组分在在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。后不同的次序从固定相中流出。按流动相分按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相在支持按固定相在支持 体中的形状分体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第二节第二节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线和色谱峰（一）色谱流出曲线和色谱

4、峰 由检测器输出的信号强度对时间作图，所由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在气固如果进样量很小，浓度很低，在气固/ /液液固吸附色谱或气液固吸附色谱或气液/ /液液分配色谱的线性范围液液分配色谱的线性范围内，则色谱峰是对称的。内，则色谱峰是对称的。（二）基线（二）基线 在实验操作条件下，在实验操作条件下，色谱柱后没有样品色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的，稳定的基线应该是一条水平直线。基线应该是一条水平直线。（三）峰高（

5、三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h h）表示。表示。 o 色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰o 基线（基线（a）o 峰高（峰高（h）（四）保留值（四）保留值 1.1.死时间死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图如下图。信号进样tM 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故故其流动速度将与流动相流动速度相近。其流

6、动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速测定流动相平均线速 时，可用柱长时，可用柱长L L与与t tM M的比值计算，即的比值计算，即 = L/tM2. 保留时间保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。过的时间，称为保留时间，如下图。信号信号进样进样tR3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后，称为某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的该组分的调整保留时间调整保留时间， 即即 tR = tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间由于组分在色谱柱中的保留时间t tR R包含了组包

7、含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，定相中滞留所须的时间，所以所以t tR R实际上是组实际上是组分在固定相中保留的总时间。分在固定相中保留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。保留体积来表示保留值。4.4.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连粒间所剩留的

8、空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，当后两项很小可忽略不计时，死体积可死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速由死时间与色谱柱出口的载气流速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）计算计算。 V0 = tMFco 式中式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。经温度校正的流速。仅适用于气相仅适用于气相色谱色谱，不适用于液相色谱，不适用于液相色谱。5. 5. 保留体积保留体积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出现柱后出现浓度极大点浓度极大点时所

9、通过的流动相的体积。保时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：留时间与保留体积关系： VR= tR Fco 6.6.调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后，称为某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。该组分的调整保留体积。 VR = VR V0 = tR Fco 7.7.相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整保的调整保留值之比，称为相对保留值。留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tR2 / tR1 = VR2 / VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有由于相对保留值

10、只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛相色谱法中，广泛用作定性的依据用作定性的依据。 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（为标准（s s），），然后再求其它峰（然后再求其它峰（i i）对这个对这个峰的相对保留值，此时可用符号峰的相对保留值，此时可用符号 表示，即表示，即 = tR (i) / tR (s) 式中式中t tR R (i)(i)为后出峰的调整保留时间，为后出峰的调整保留时间，所以所以 总是大于

11、总是大于1 1的。相对保留值往往可作为的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。 ( (五五) ) 区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有域宽度通常有三种方法三种方法。1.1.标准偏差标准偏差 即即0.6070.607倍峰高处色谱峰倍峰高处色谱峰宽的一半。宽的一半。2.2.半峰宽半峰宽Y Y1/21/2即峰高一半处对应的峰宽。即峰高一半处对

12、应的峰宽。它与标准偏差的关系为它与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰底宽度峰底宽度Y Y即色谱峰两侧拐点上的切即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏线在基线上截距间的距离。它与标准偏差差 的关系是的关系是 Y = 4 Y = 4 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：( (i) i) 根据色谱峰的个数根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含，可以判断样品中所含 组组分的最少个数；分的最少个数；( (ii) ii) 根据色谱峰的保留值根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；，可以进行定性分析；( (iii) ii

13、i) 根据色谱峰的面积或峰高根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量，可以进行定量分析；分析；( (iv) iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱，是评价色谱柱分离效能的依据；柱分离效能的依据；( (v) v) 色谱峰两峰间的距离色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。动相）选择是否合适的依据。 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离，组分，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色的

14、距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。面来研究色谱行为。 （一）分配系数（一）分配系数K K和分配比和分配比k k1.1.分配系数分配系数K K 分配色谱的分离是

15、基于样品组分在固定相和分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的分离是基于反复多次的吸附吸附- -脱附脱附过程。过程。 这种分离过程经常用样品分子在两相间的分这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K K。 它（它（K K）是指在一定温度和压力下，组分是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即之比值，即 K= K=溶质在固定相中的浓度溶质在固定

16、相中的浓度/ / 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm 分配系数是由组分和固定相的热力分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：值，它仅与两个变量有关：固定相和温固定相和温度度。与两相体积、柱管的特性以及所使。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。用的仪器无关。2.2.分配比分配比 k k 分配比又称分配比又称容量因子容量因子，它是指在一定温，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。分配在固定相和流动

17、相中的物质的量比。即即 k = 组分在固定相中的物质的量组分在固定相中的物质的量 / 组分在流动相中的物质的量组分在流动相中的物质的量 = ns / nm k k值越大，说明组分在固定相中的量越多，值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容分配容量或容量因子量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。能力的重要参数。k k值也决定于组分及固定相值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。化，而且还与流动相

18、及固定相的体积有关。 k = ns / nm =CsVS / CmVm 式中式中c cs s,c,cm m分别为组分在固定相和分别为组分在固定相和流动相的浓度；流动相的浓度；V Vm m为柱中流动相的体为柱中流动相的体积，近似等于死体积。积，近似等于死体积。VsVs为柱中固定为柱中固定相的体积相的体积，在各种不同的类型的色谱在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。中有不同的含义。例如：在分配色谱中，例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。相的孔体积。 分配比分配比 k 值可直接从色谱图中测得值可直接从色谱图中

19、测得。 k = (t R t M ) / t M = t R / t M = V R / V 0 3. 分配系数分配系数K与分配比与分配比 k 的关系的关系 K = kVS/VM =k . 其中其中称为相比称为相比，它是反映各种色谱柱柱型，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为值一般为6-35；对毛细管柱，其；对毛细管柱，其值为值为60-600。滞留因子滞留因子Rs 分配比分配比k k值可直接从色谱图测得。设流值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为动相在柱内的线速度为u u，组分在柱内线速组分在柱内线速度为度为u us s

20、，由于固定相对组分有保留作用，由于固定相对组分有保留作用，所以所以u us su u此两速度之比称为此两速度之比称为滞留因子滞留因子RsRs。 rmssttuuRRs若用质量分数表示，即若用质量分数表示，即 对组分和流动相通过长度为对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，的色谱柱，其所需时间分别为其所需时间分别为knnnnnRmssmms1111sruLtuLtm整理得整理得 )1 (kttmrmrmrmmrVVtttttk 4.分配系数分配系数 K 及分配比及分配比 k 与选择因子与选择因子的关系的关系 对对A、B两组分的选择因子，用下式表示：两组分的选择因子，用下式表示： = t R (B)

21、/ t R (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通过选择因子通过选择因子把实验测量值把实验测量值k与热力学性与热力学性质的分配系数质的分配系数K直接联系起来，直接联系起来，对固定相的对固定相的选择具有实际意义。选择具有实际意义。 如果两组分的如果两组分的K K或或k k值相等，则值相等，则=1=1，两个组分的色谱峰必将重合，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的说明分不开。两组分的K K或或k k值相差越值相差越大，则分离得越好大，则分离得越好。因此两组分具有。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条不同的分配系数是色谱分离的先决条件。件。 下图是下图是

22、 A、B两组分沿色谱柱移动时，不两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。同位置处的浓度轮廓。 浓度浓度沿柱移动距离沿柱移动距离 LABABKA KB 图中图中K KA AKKB B ，因此，因此，A A组分在移动过程中滞后。组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使利的，但又是不可避免的。若要使A A、B B组分完全分组

23、分完全分离，必须满足以下三点：离，必须满足以下三点： 第一第一，两组分的分配系数必须有差异；，两组分的分配系数必须有差异；第二第二，区域扩宽的速率应小于区域分，区域扩宽的速率应小于区域分 离的速度；离的速度；第三第三，在保证快速分离的前提下，提，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。供足够长的色谱柱。 第一、二点是完全分离的必要条件第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。素。塔板理论和速率理

24、论均以色谱过程塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提中分配系数恒定为前提，故称为线性色，故称为线性色谱理论。谱理论。小小 结结 色谱法研究的核心色谱法研究的核心-选择最选择最适合的色谱体系和条件、在最短的适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。时间达到最佳的分离效果。（二）塔板理论二）塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、，即色谱柱是由一系列连

25、续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用用H H表示，称为塔板高度，简称板高。表示，称为塔板高度，简称板高。 塔板理论假设：塔板理论假设：1.1. 在柱内一小段长度在柱内一小段长度H H内，组分可以在两相间内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度高度H H。2.2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（板体积（VVm m）。）。3.3. 所有组分开始时存在于第所有组分开始时存在

26、于第0 0号塔板上，而且号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。某一塔板上的量无关。 简单地认为：在每一块塔板上，溶质在简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：的色谱柱，溶质平衡的次数应为： n = L / H n n称为理论塔板数称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱。与精馏塔一

27、样，色谱柱的柱效随理论塔板数柱的柱效随理论塔板数n n的增加而增加，随板的增加而增加，随板高高H H的增大而减小。的增大而减小。 根据上述假定，在色谱分离过程中，该组根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：分的分布可计算如下： 开始时，若有单位质量，即开始时，若有单位质量，即m=1m=1（例例1 1mgmg或或1 1gg）的该组分加到第的该组分加到第0 0号塔板上，分号塔板上，分配平衡后，由于配平衡后，由于k=1k=1，即即n ns s=n=nm m故故n nm m=n=ns s=0.5=0.5。当一个板体积（当一个板体积（lVlV）的载气以脉动形式进的载气以脉动形式进入入0

28、0号板时，就将气相中含有号板时，就将气相中含有n nm m部分组分的部分组分的载气顶到载气顶到1 1号板上，此时号板上，此时0 0号板液相（或固相）号板液相（或固相）中中n ns s部分组分及部分组分及1 1号板气相中的号板气相中的n nm m部分组分，部分组分，将各自在两相间重新分配。将各自在两相间重新分配。故故0 0号板上所含号板上所含组分总量为组分总量为0 05 5，其中气液（或气固）两相其中气液（或气固）两相各为各为0 025,25,而而1 1号板上所含总量同样为号板上所含总量同样为0 05 5气液（或气固）相亦各为气液（或气固）相亦各为0 02525。以后每当一个新的板体积载气以脉动

29、以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一式进入色谱柱时，上述过程就重复一次次( (见下表见下表) )。 塔板理论指出塔板理论指出： 第一第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数论塔板数n n大于大于5050时时，可得到基本对称的峰，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，形曲线。在色谱柱中，n n值一般很大，如气值一般很大，如气相色谱柱的相色谱柱的n n约为约为10103 3 -10 -106 6 ，因而这时的流，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。出曲线可趋近于正态分布曲线。 第二第二，当样品进入色谱柱后，只要各组，当样品进入色谱柱后

30、，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。分离。第三第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：与半峰宽及峰底宽的关系式为： n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 式中式中tR 与与Y1/2 ( Y )应采用同一单位（时应采用同一单位（时间或距离）。从公式可以看出，在间或距离）。从公式可以看出，在tR 一定时，一定时，如果色谱峰很窄，则说明如果色谱峰很窄，则说明n越大，越大，H越小，柱越小，柱效能越高。效能越高。在实际工作中，由公式在实际工作中，由公式

31、 n = L / H和和 n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 计算出来的的计算出来的的n和和H值有时并不能充分地反值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，计算时，没有扣除死时间没有扣除死时间tM， 所以常用有效塔板数所以常用有效塔板数n有效有效表示柱效：表示柱效： n有效有效= 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 ( tR / Y)2 有效板高有效板高 ： H有效有效 = L / n有效有效 因为在相同的色谱条件下，对不同的物质因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，

32、计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。行测量。例：例：已知某组分峰的峰底宽为已知某组分峰的峰底宽为40 s，保留时间保留时间为为400 s ，计算此色谱柱的理论塔板数。计算此色谱柱的理论塔板数。 解：解： n = 16 ( tR / Y)2 = 16 （400 / 40）2 = 1600 块块 塔板理论是一种半经验性理论。塔板理论是一种半经验性理论。它用热力它用热力学的观点学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和率，解释了流出曲线的形状，

33、并提出了计算和评价柱效高低的参数。评价柱效高低的参数。 但是但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。板数，因而限制了它的应用。1、从理论上得到了描述色谱流出曲线的从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该方程可以预测具

34、有不同分方程，通过该方程可以预测具有不同分配系数配系数K的两种物质在塔板数为的两种物质在塔板数为n的色谱的色谱柱上分离的情况；柱上分离的情况；小结小结2、通过这一方程看出影响柱效率的因素通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数是理论板数n，其值越大，色谱峰月窄，其值越大，色谱峰月窄，分离效果越好；分离效果越好；3、既然色谱分离的依据是组分在两相既然色谱分离的依据是组分在两相中的分配能力差异，因此，两相不限于中的分配能力差异，因此，两相不限于液液-固相，对气体成分而言，亦可是气固相，对气体成分而言，亦可是气-固项或气固项或气-液相。液相。（三）速率理论（三）速率理论 1956 1956年荷兰学

35、者年荷兰学者van Deemter（范第姆特）范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论理论速率理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。液相色谱都适用。 van Deemter方程方程的数学简化式为的数学简化式为 H = A + B / u + C u 式中式中u为流动相

36、的线速度；为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。扩散项系数、传质阻力项系数。1.1.涡流扩散项涡流扩散项 A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称称涡流扩散。涡流扩散。 由于填充物颗粒大小的不同及填充由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径物

37、的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：定： A = 2dp 上式表明，上式表明，A与填充物的平均直径与填充物的平均直径dp的的大小和填充不规则因子大小和填充不规则因子有关有关，与流动相的，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。粒，并且填充均匀是十分必要

38、的。对于空对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此心毛细管，不存在涡流扩散，因此 A = 0。2. 分子扩散项分子扩散项 B / u （纵向扩散项）纵向扩散项） 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈呈“塞子塞子”状。它随着流动相向前推进，状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，由于存在浓度梯度，“塞子塞子”必然自发必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分分子扩散项系数为子扩散项系数为 B = 2 DgB/u（纵向分子扩散项） 指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展

39、宽B = 2 Dm式中： 弯曲因子，填充柱 1 空心柱 = 1 Dm组分在流动相中的扩散系数由于组分在液相中的扩散系数只有气体中由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的的1/105，因此在液相色谱中，因此在液相色谱中B可以忽略。可以忽略。 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中为组分在流动相中扩散系数扩散系数（cm3s-1）,分分子扩散项与组分在流动相中子扩散项与组分在流动相中扩散系数扩散系数Dg成正成正比比

40、. D Dg g与流动相及组分性质有关：与流动相及组分性质有关： ( (a)a) 相对分子质量大的组分相对分子质量大的组分D Dg g小，小，D Dg g反比于反比于流动相相对分子质量的平方根，所以流动相相对分子质量的平方根，所以采用相采用相对分子质量较大的流动相，可使对分子质量较大的流动相，可使B B项降低项降低； ( (b)b) D Dg g随柱温增高而增加，但反比于柱压。随柱温增高而增加，但反比于柱压。 另外纵向扩散与另外纵向扩散与组分在色谱柱内停组分在色谱柱内停留时间有关留时间有关，流动相流速小，组分停，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降留时间长，纵向扩散就大。因此为

41、降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略扩散可以忽略。3. 3. 传质阻力项传质阻力项 C Cu u 由于气相色谱以气体为流动相，液由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。程不完全相同。（1 1）气液色谱）气液色谱 传质阻力系数传质阻力系数C C包括气相传质阻力包括气相传质阻力系数系数C Cg g和液相传质阻力系数和液相传质阻力系数C C1 1两项，即两项，即 C = Cg+ C1 气相传质过程是指试样组分从气相气相传

42、质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程移动到固定相表面的过程。这一过程中。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样使得两相界面又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数对于填充柱，气相传质阻力系数C Cg g为：为：式中式中k k为容量

43、因子为容量因子。由上式看出，气相传质阻力。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度与填充物粒度d dp p的平方成正比，与组分在载气流的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数中的扩散系数D Dg g成反比。因此，成反比。因此，采用粒度小的填采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使可使C Cg g减小，提高柱效。减小，提高柱效。gpgDdkkC222)1(01.0 液相传质过程是指试样组分从固定液相传质过程是指试样组分从固定相的气相的气/ /液界面移动到液相内部，并发液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡生质量交换，达到分

44、配平衡，然后又返，然后又返回气回气/ /液界面的传质过程。这个过程也液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。是造成峰形扩张。 液相传质阻力系数液相传质阻力系数 C C1 1为：为： 由上式看出，固定相的液膜厚度由上式看出，固定相的液膜厚度d df f薄，薄，组分在液相的扩散系数组分在液相的扩散系数D D1 1大，则液相传质大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但液膜厚度，但k k值随之变小，又会使值

45、随之变小，又会使C C1 1增大。增大。lflDdkkC22)1(32 当固定液含量一定时，液膜厚度随当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分离。虽然提高柱温可尾峰，也不利于分离。虽然提高柱温可增大增大D D1 1，但会使但会使k k值减小，为了保持适当值减小，为了保持适当的的C C1 1值，应控制适宜的柱温。值，应控制适宜的柱温。将上面式总结，即可得将上面式总结，即可得气液色谱速率板高

46、方程气液色谱速率板高方程 这一方程对选择色谱分离条件具有实际这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响定相的液膜厚度等对柱效的影响。 uDkkdDdkkuDdHlfrpgp)1 (32)1 (01. 02222222 （2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相和固定相传质系数（传质系数（Cs），），即即 CCmCs 其中其中C

47、m又包含流动的流动相中的传质阻力又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即和滞留的流动相中的传质阻力，即 mpsmmpmmDdDdC22 式中右边第一项为流动的流动相中式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀。动相的流速是不均匀。m是由柱和填充的性质决定的因子；是由柱和填充的性质决定的因子；sm是一常数，它与颗粒微孔中被流动是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的

48、分数及容量因子有关。相所占据部分的分数及容量因子有关。 液液色谱中固定相传质阻力液液色谱中固定相传质阻力系数（系数（CsCs）可用下式表示：可用下式表示： sfssDdC2 该式与气液色谱速率方程的形该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，式基本一致，主要区别在液液色谱中主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项主要因素是传质阻力项。 综上所述，对综上所述，对液液色谱的液液色谱的Van Deemter方程式方程式可表达为：可表达为： uDdDdDduDdHsfsmpsmmpmmp)(22222问题：问题：1、空心柱是否能够用于色谱分离

49、？空心柱是否能够用于色谱分离？2、如何获得色谱最佳流速？如何获得色谱最佳流速？0dCuuBddAdH02CuBdudH u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：应求出最佳值：4. 流动相线速度对板高的影响流动相线速度对板高的影响（1）LC和和GC的的H-u图图 根据根据van Deemter公式作公式作LC和和GC的的H-u图，图，LC和和GC的的H-u图十分相似图十分相似，对应某对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；值就是柱效最高点； LC板高极小值比板高极小值比GC的极小值小的极小值小一个数

50、量级以上一个数量级以上，说明液相色谱的柱，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多；效比气相色谱高得多；LC的板高最低的板高最低点相应流速比起点相应流速比起GC的流速亦小一个的流速亦小一个数量级，说明对于数量级，说明对于LC，为了取得良好为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。的柱效，流速不一定要很高。(2) 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献较低线速时，较低线速时，分子扩散项起主要作用；分子扩散项起主要作用；较较高线速时，高线速时，传质阻力项起主要作用传质阻力项起主要作用；其中流；其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值。

51、值。在高线速度时，在高线速度时，固定相传质阻力项成为影固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素响板高的主要因素，随着速度增高，板高值，随着速度增高，板高值越来越大，柱效急剧下降。越来越大，柱效急剧下降。 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献5. 固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响 粒度越细，板高越小，并且受线速度影粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。响亦小。 这就是为什么在这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相柱流速愈慢。

52、只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。流速才能符合实验要求。 固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响 第四节第四节 分离度分离度 分离度分离度R是一个综合性指标。是一个综合性指标。 分离度是既能反映分离度是既能反映柱效率柱效率又能反映又能反映选择选择性性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即即 R = 2 (tR2 - tR1) / (W1 +W2 ) R值越大，表明相邻两组分分离越好。

53、值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当一般说，当R1时，两峰有部分重叠；当时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达时，分离程度可达98%；当；当R=1.5时，时，分离程度可达分离程度可达99.7%。 通常用通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分作为相邻两组分已完全分离的标志。离的标志。 图图1表示不同分离度时色谱峰分离的程度表示不同分离度时色谱峰分离的程度 基本的色谱方程的表达式基本的色谱方程的表达式(P372)(P372)1)(1(4kknR1.分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系 由分离方程式看出，具有一定相对保由分离方程式看出，具有一定相对保留值留值的物质对，分离度直接和有效塔板

54、数的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的被分离物质对的确定后，分离度将取决于确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即平方与柱长成正比，即2121221)(LLnnRR 说明用柱长的色谱柱可以提高分离说明用柱长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此，提高分度，但延长了分析

55、时间。因此，提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。柱子，通过降低板高，以提高分离度。2. 分离度与选择因子的关系分离度与选择因子的关系 由基本色谱方程式判断，当由基本色谱方程式判断，当 = 1时，时，R = 0。这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，显然，大，选择性好。研究证明大，选择性好。研究证明的微小变化，的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成，可有效增大定相和流动相的性质和组成，可有效增大值。值。5基本色谱分离方程式的应用基本色谱分离方程式的应用 在实际中，