蛋白质分离纯化

1、第二章蛋白质与其它生物分子第二章蛋白质与其它生物分子的相互作用的相互作用 糖蛋白的存在膜蛋白类膜蛋白类 血型抗原血型抗原ABO 免疫球蛋白免疫球蛋白 膜受体膜受体分泌蛋白类分泌蛋白类消化道上皮分泌黏液消化道上皮分泌黏液中有中有颌下腺粘蛋白颌下腺粘蛋白胃粘蛋白胃粘蛋白胞外体液中有胞外体液中有:血清清蛋白血清清蛋白血清粘蛋白血清粘蛋白运铁蛋白运铁蛋白血浆铜蓝蛋白血浆铜蓝蛋白凝血酶原凝血酶原免疫球蛋白免疫球蛋白补体补体 结构蛋白结构蛋白胶原蛋白胶原蛋白层粘蛋白层粘蛋白纤连蛋白纤连蛋白糖蛋白的生物学功能1、参与新生肽的链的折叠和缔合参与新生肽的链的折叠和缔合2、参与糖蛋白的分泌和转运、参与糖蛋白的分泌

2、和转运3、参与分子识别和细胞识别（如：受体与配、参与分子识别和细胞识别（如：受体与配体、精子与卵子的识别、根瘤菌与豆科植体、精子与卵子的识别、根瘤菌与豆科植物、病原微生物对寄生植物的感染物、病原微生物对寄生植物的感染细胞粘着等）研究糖蛋白的应用 利用外源凝集素作为探针鉴别肿瘤细胞利用外源凝集素作为探针鉴别肿瘤细胞肿瘤细胞需要较低浓度的外源凝集素，比正肿瘤细胞需要较低浓度的外源凝集素，比正常低常低10-20倍倍。（一）组成糖蛋白糖链的单糖（一）组成糖蛋白糖链的单糖一、糖蛋白的结构一、糖蛋白的结构 常见的单糖及其衍生物常见的单糖及其衍生物 名名 称称 英英 文文 名名 缩缩 写写 -D- -葡萄糖

3、葡萄糖 -D-glucose ( Glc ) -D- -半乳糖半乳糖 -D-galactose ( Gal ) -D- -甘露糖甘露糖 -D-mannose ( Man ) L- -岩藻糖岩藻糖 L-Fucose ( Fuc )N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺 N-acetylglucosamine ( GlcNAc )N-乙酰半乳糖胺乙酰半乳糖胺 N-acetylgalactosamine ( GalNAc )N-乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸 N-acetylneuraminic acid ( NeuAc )OONHC=OCH3CH2OH NH CH2-CH C=OO O NHN-C-CH2-CH

4、C=O CH2OH Asn -GlcNAcSer(Thr)O-O-连接寡糖连接寡糖N-N-连接寡糖连接寡糖 -GalNAc（二）糖链与蛋白质连接方式及其分类（二）糖链与蛋白质连接方式及其分类NHC=OCH3OHN乙酰半乳糖N乙酰葡萄糖N-连接糖蛋白连接糖蛋白（1）糖基化位点）糖基化位点 特异的氨基酸序列（也称序列子）：特异的氨基酸序列（也称序列子）：Asn X - Ser/Thr X 可以是可以是 Pro 以外的任何氨基酸。序以外的任何氨基酸。序列中列中X位氨基酸的性质可能与合成的糖链结位氨基酸的性质可能与合成的糖链结构有关构有关（2 2）N-N-连接寡糖的基本结构连接寡糖的基本结构 Man

5、Man GlcNAc GlcNAc AsnMan 1,6 1,4 1,3 1,4分型：分型：五糖核心区：五糖核心区：1 1、高甘露糖型：、高甘露糖型：只含有只含有Man和和GlcNAc,而且只有而且只有Man 连接在五糖核心区上的连接在五糖核心区上的N-糖链。糖链。2.、复杂型：、复杂型：除含有除含有Man和和GlcNAc外，还有外，还有Gal、Fuc 和和NeuAc的的N-糖链。糖链。基本结构基本结构是由五糖核是由五糖核 心区上加一些可变数目的心区上加一些可变数目的 N-乙酰氨基乳糖，乙酰氨基乳糖， 即即( Gal 14GlcNAc )n所构成的外围链，而所构成的外围链，而 Gal可以连接着

6、可以连接着NeuAc。 核心核心Fuc 指以指以 16 糖苷键方式连接在五糖核心糖苷键方式连接在五糖核心 区紧靠肽链区紧靠肽链 Asn 残基的残基的 GlcNAc上的上的Fuc。平分型平分型 GlcNAc 指在五糖核心区的指在五糖核心区的 -Man上以上以 14糖苷键连接的糖苷键连接的 GlcNAc。3 3、杂合型（也称混合型）：、杂合型（也称混合型）：指既有高甘露糖型结构特指既有高甘露糖型结构特 点，又有复杂型结构特征，即点，又有复杂型结构特征，即N-乙酰氨基乙酰氨基 乳糖重复单位连接在五糖核心区上的乳糖重复单位连接在五糖核心区上的N-糖糖 链。也可含有平分型链。也可含有平分型GlcNAc。

7、（3 3）N-N-连接寡糖的生物合成连接寡糖的生物合成 a a、合成场所：、合成场所：内质网和高尔基体内质网和高尔基体，与肽链合成，与肽链合成同时进行。同时进行。 b b、糖链载体：长萜醇（、糖链载体：长萜醇（dolichol, Doldolichol, Dol） CH3 CH3 O OHCH2-C=CH-CH2CH2-CH-CH2-O-P-O-P-O-糖基糖基 O ON（15-19）异戊烯单位异戊烯单位长萜醇长萜醇 c c、糖基供体：、糖基供体： 如：如：UDP-Gal（GlcNAc、GalNAc） GDP-Man（Fuc） Dol-Man（Glc）长萜醇类长萜醇类 d、酶：、酶：各种特异性

8、的糖基转移酶各种特异性的糖基转移酶 核苷酸类核苷酸类e、合成的主要过程：、合成的主要过程： （a）长萜醇焦磷酸寡糖（）长萜醇焦磷酸寡糖（G-糖）的合成。糖）的合成。（b b）G-G-寡糖转移到肽链糖基化位点上并进一步寡糖转移到肽链糖基化位点上并进一步 加工修饰，形成各型糖链。加工修饰，形成各型糖链。Man-Man ManMan-Man Man-Man ManGlc-Glc-Glc-pp-DolMan-GlcNAc-GlcNAc- 长萜醇焦磷酸寡糖（长萜醇焦磷酸寡糖（G-G-糖）的合成糖）的合成膜蛋白中的糖膜蛋白中的糖膜膜蛋蛋白白分分子子中中的的糖糖糖链的分支结构糖链的分支结构糖蛋白中糖链的生物

9、学功能1、参与新生肽的折叠与缔合、参与新生肽的折叠与缔合例：基因定点突变所得去糖基化抗胰蛋白酶不例：基因定点突变所得去糖基化抗胰蛋白酶不能正确折叠。能正确折叠。2、影响糖蛋白的分泌和稳定性、影响糖蛋白的分泌和稳定性例：去例：去N-糖链的免疫球蛋白不能被分泌到胞外糖链的免疫球蛋白不能被分泌到胞外3、参与分子识别和细胞识别、参与分子识别和细胞识别例：精卵识别、细胞粘着、淋巴归巢、血浆老例：精卵识别、细胞粘着、淋巴归巢、血浆老糖蛋白的清除、抗原抗体的结合、酶底物的糖蛋白的清除、抗原抗体的结合、酶底物的结合、激素与受体的结合等结合、激素与受体的结合等4、维持激素活性维持激素活性例：促卵泡激素、促黄体激

10、素等，其中所含例：促卵泡激素、促黄体激素等，其中所含糖链与其生物活性及半衰期有关。糖链与其生物活性及半衰期有关。5、维持、维持IgG的活性的活性如如IgG缺失糖链，则自身成为成为抗原产生抗缺失糖链，则自身成为成为抗原产生抗体，生成免疫复合体，沉积于关节炎引起体，生成免疫复合体，沉积于关节炎引起炎症。炎症。6、 决定血型决定血型 二、糖蛋白寡糖链的功能二、糖蛋白寡糖链的功能( (一）寡糖链对糖蛋白新生肽链的影响一）寡糖链对糖蛋白新生肽链的影响1 1、参与肽链的折叠和亚基聚合，保障正确构象的形、参与肽链的折叠和亚基聚合，保障正确构象的形 成。成。如：如：运铁蛋白受体（运铁蛋白受体（Asn 251、

11、317 和和 727） Asn-727为高露糖型为高露糖型N-连接糖链，与折叠和运连接糖链，与折叠和运 输关系密切。输关系密切。 Asn-251为三天线复杂型为三天线复杂型N-连接糖链，与二聚连接糖链，与二聚体形成相关。体形成相关。2 2、引导糖蛋白在体内的分拣和、引导糖蛋白在体内的分拣和运运送送( (二）寡糖链对糖蛋白生物活性的影响二）寡糖链对糖蛋白生物活性的影响 1 1、保护肽链不易被酶水解，延长其半衰期。、保护肽链不易被酶水解，延长其半衰期。 2 2、影响酶（蛋白质）的生物活性、影响酶（蛋白质）的生物活性。 如：如： a a、HMGCoAHMGCoA还原酶去糖链后，活性下降还原酶去糖链后

12、，活性下降90%90%。 b b、脂蛋白脂酶的、脂蛋白脂酶的N-N-糖链的五糖核心是活性糖链的五糖核心是活性 必需的。必需的。 （三）寡糖链与分子识别作用（三）寡糖链与分子识别作用 1、精、精-卵细胞的结合：卵细胞的结合： 精子头部的精子蛋白识别卵细胞表面透明带中精子头部的精子蛋白识别卵细胞表面透明带中 ZP-3 糖蛋白的糖蛋白的 O-连接糖链，产生顶体反应。连接糖链，产生顶体反应。 2、激素受体、激素受体-配体的结合：配体的结合： 3、细胞粘附作用：参与细胞粘附的分子大多是、细胞粘附作用：参与细胞粘附的分子大多是N-糖糖 链的糖蛋白。链的糖蛋白。 如整合蛋白（如整合蛋白（integrin）可

13、与纤连蛋白（）可与纤连蛋白（Fibronectin，Fn）结合，但必须依赖其完整的）结合，但必须依赖其完整的N-糖链；去除糖链；去除或改变或改变糖链。糖链。均可降低其与均可降低其与Fn 的识别和结合能力。的识别和结合能力。 4、血型与血型物质；、血型与血型物质；ABO血型的抗原系统血型的抗原系统 抗原抗原 糖链非还原末端结构糖链非还原末端结构 A GalNAc 1,3( Fuc 1,2 )Gal 1,3 GlcNAc- B Gal 1,3( Fuc 1,2 )Gal 1,3 GlcNAc- H Fuc 1,2 Gal 1,3 GlcNAc- 血管内皮细胞白细胞黏附分子，后改称血管内皮细胞白细胞

14、黏附分子，后改称E E选择蛋白（选择蛋白（E Eselectinselectin），能识别白细胞），能识别白细胞表面的表面的SLexSLex( (一种血型抗原）四聚糖。一种血型抗原）四聚糖。 当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫疾病。疾病。 美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成了了SLexSLex，当时该四糖的推算

15、价格为，当时该四糖的推算价格为2020亿亿美元美元/ /千克，经他合成后，价格降低了千克，经他合成后，价格降低了3 34 4个数量级，并已由个数量级，并已由CytelCytel公司生产。公司生产。 GlycomedGlycomed公司则从中药甘草中，找到了公司则从中药甘草中，找到了SLexSLex的类似物甘草素，可用于封闭血管的类似物甘草素，可用于封闭血管内皮细胞表面的内皮细胞表面的E E选择蛋白，从而达到抗选择蛋白，从而达到抗炎的目的。炎的目的。蛋白聚糖蛋白聚糖(proteoglycans(proteoglycans) ) 由糖胺聚糖于蛋白质共价连接形成由糖胺聚糖于蛋白质共价连接形成 糖胺聚

16、糖是由己糖醛酸、己糖胺二糖单位糖胺聚糖是由己糖醛酸、己糖胺二糖单位重复构成重复构成 蛋白聚糖的功能：维持皮肤、关节、软骨蛋白聚糖的功能：维持皮肤、关节、软骨等结缔组织形态和功能。等结缔组织形态和功能。 糖胺聚糖，又称为糖胺多糖、粘多糖糖胺聚糖，又称为糖胺多糖、粘多糖 、氨、氨基多糖、酸性糖胺聚糖等。糖胺聚糖通过共基多糖、酸性糖胺聚糖等。糖胺聚糖通过共价键与蛋白质相连接构成蛋白聚糖价键与蛋白质相连接构成蛋白聚糖 其代表性物质有透明质酸、软骨素其代表性物质有透明质酸、软骨素4-4-或或6-6-硫硫酸酸 、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸角质素 、肝素及硫、肝素及硫酸乙酰肝素等。酸乙酰肝素等

17、。粘粘多多糖糖的的结结构构硫酸软骨素硫酸角质素透明质酸细胞壁多糖细胞壁多糖细胞壁多糖细胞壁多糖五甘氨酸桥胞壁酸N乙酰葡糖胺细胞细胞壁多壁多糖与糖与蛋白蛋白的连的连接接透明质素硫酸角质素硫酸软骨素透明质酸透明质酸(hyaluronic(hyaluronic acid) acid) 透明质酸是糖胺聚糖中结构最简单的一种，它透明质酸是糖胺聚糖中结构最简单的一种，它的结构中含有重复的二糖结构单位如下：的结构中含有重复的二糖结构单位如下：软骨素软骨素4-4-或或6-6-硫酸硫酸(chondroitin(chondroitin 4-or 4-or 6-sulfate)6-sulfate) 硫酸皮肤素硫酸皮

18、肤素(dermatan(dermatan sulfate)sulfate) 硫酸皮肤素最初是从猪皮中分离出来，后发现它存硫酸皮肤素最初是从猪皮中分离出来，后发现它存在于许多动物组织，如猪胃粘膜、脐带、肌腱、脾、在于许多动物组织，如猪胃粘膜、脐带、肌腱、脾、脑、心瓣膜、巩膜、肠粘膜、关节囊、纤维性软骨脑、心瓣膜、巩膜、肠粘膜、关节囊、纤维性软骨等中。等中。 它的结构与性质都与硫酸软骨素的相似，其二精单它的结构与性质都与硫酸软骨素的相似，其二精单位结构如下：位结构如下： 硫酸角质素硫酸角质素(keratan (keratan suIfatesuIfate) ) 首先从角膜的蛋白水解液中分离出来，后证首先从角膜的蛋白水解液中分离出来，后证明它也存在于人的主动脉和人、牛的髓核中。明它也存在于人的主动脉和人、牛的髓核中。婴儿几乎不合硫酸角质索，随着年龄的增大婴儿几乎不合硫酸角质索，随着年龄的增大逐渐增加，直到逐渐增加，直到20203030岁时，它的含量约占岁时，它的含量约占肋软骨中粘多糖总量的肋软骨中粘多糖总量的50%50%。 硫酸角质素的重复二糖单位结构如下硫酸角质素的重复二糖单位结构如下： 肝素肝素(heparin)(heparin) 肝中肝素含量最为丰富，因此得名。实际上，它广肝中肝素含量最为丰富，因此得名。实际上，它广泛分布于哺乳动物组织和体液中