黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究

1、黑曲霉GZUF36包外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究脂肪酶是一种极具商业价值的丝氨酸水解酶类,可用于食品、医药、化工等行业。但大多数天然脂肪酶都存在稳定性差、易变性失活以及不可回收利用等缺点,这导致脂肪酶的应用受到限制。因止匕，本研究采用来自于黑曲霉GZUF36勺胞外脂肪酶(extracellularlipasefromAspergillusnigerGZUF36,ANL)进行交联酶聚集体(Cross-linkedenzymeaggregates,CLEAs)制备,以获得酶活力高、稳定性强且可多次回收利用的固定化脂肪酶。此外，通过对黑曲霉GZUF36包外脂肪酶交联酶聚集体(CLEAs-ANL)

2、酶学性质、二级结构、形态外貌以及选择性进行研究，为后续该酶在功能性油脂的合成以及工业化大规模应用提供参考依据和理论基础。主要内容和结果如下:(1)当叔丁醇与粗酶液体积为4:1,交联剂添加量为30屋，交联时间为1.5小时，离心转数为6000r/min时为制备CLEAs-ANL勺最佳条件。在该条件下，CLEAs-ANL酶活回收率为100.3±1.1%,酶活力可达13.8±0.51u/ml。研究了不同添加剂如BSABSAK解产物、油酸、庚烷、Tween-80、以及SDS等对CLEAs-ANL舌性的影响，结果显示BSABSA水解液,Tween-80都可对CLEAs-ANL舌性起至I

3、J改善作用，CLEAs-ANL酶活回收率分别可提高11.3%、6.5%、4%而油酸、SDSffi正庚烷对CLEAs-ANL舌力会产生负面影响，不适合用作CLEAs-AN用备的添加剂。(2)通过丙酮沉淀与反胶束萃可对黑曲霉GZUF36包外脂肪酶进行部分纯化。电泳结果显示介于3143之间出现的条带为目标条带。将部分纯化的脂肪酶用于制备CLEAs并研究其酶学性质。结果显示CLEAs-ANL勺最适温度为40C,较游离酶增加了5C。在最适反应pH方面，游离酶最适反应pH为6.5,而CLEAs-ANlfipH4.0-6.0差异不显著。说明该脂肪酶固定化后表现出较好的耐酸性。CLEAs-AN卬仅在温度稳定性

4、和pH稳定性方面显示出比游离酶更高的稳定性。而且在不同有机溶剂中的耐受性也普遍高于游离酶。在储藏稳定性方面，游离酶和CLEAs-ANL®储藏30天后相对酶活分别为26.3±1.6%和82.5±4.1%。证明该脂肪酶经交联后储藏稳定性得到改善。在操作稳定性方面，CLEAs-ANLiE经过8次回收利用以后仍保持34.9%的相对酶活，操作稳定性良好。最后，通过对游离酶和CLEAs-ANL勺动力学参数测定，游离酶的VmaxF口Km另15.9和44.35,而CLEAs-ANL勺Vma/口Km另11.95和226,表明该脂肪酶经固定化后底物亲和性和最大反应速度降低。(3)通过

5、FTIR检测结果显示，CLEAs-ANL的0-折叠和B-转角相对于游离酶分别增加了31.54%?口2.88%,而a-螺旋和无规则卷曲分别减少了5.05%?口29.32%,这说明该脂肪酶经交联后刚性增强而柔性降低。SEM吉果显示CLEAs-AN假面结构相对于游离酶更紧凑和均匀。且在15;000X放大倍率下可观察到表面有簇状和空穴,表明底物分子与酶催化位点更容易接触,这利于反应的进行。CLEAs-ANL勺粒径约在50m左右。该粒径符合一般CLEAsB勺粒径范围。最后通过TLC和HPLC8行选择性分析可知，游离酶和CLEAs-AN在水解反应中都显示sn-1,3位置选择性。说明交联过程不会对CLEAs-ANLt水解反应中的位置选择性产生影响，而通过与ppl的产物对比，游离酶和CLEAs-ANLt水解反应中显示出的sn-1,3位置选择性高于ppl。然而,在甘油解反应中未检测到游离酶甘油解的反应产物,而CLEAs-ANL勺甘油解反应产物中不