八章DNA或蛋白质的化学修饰与基因表达ppt课件

1、第八章第八章DNA或蛋白质的化学修或蛋白质的化学修饰与基因表达饰与基因表达 一、一、 DNA甲基化与基因表达甲基化与基因表达 二、二、 蛋白质磷酸化与基因表达蛋白质磷酸化与基因表达 三、三、 基因重排的分子机制基因重排的分子机制 一、一、 DNA甲基化与基因表达甲基化与基因表达 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，甲基化是最早发现的修饰途径之一，能够存在于一切高等生物中。能够存在于一切高等生物中。DNA甲基化甲基化能封锁某些基因的活性，去甲基化那么诱能封锁某些基因的活性，去甲基化那么诱导了基因的重新活化和表达。导了基因的重新活化和表达。 1DNA甲基化的主要方式甲基化的主要方式 5-甲基胞嘧

2、啶，甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和甲基腺嘌呤和7-甲基甲基鸟嘌呤。在真核生物中，鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主甲基胞嘧啶主要出如今要出如今CpG和和CpXpG中，原核生物中中，原核生物中CCA/TGG和和GATC也常被甲基化。也常被甲基化。 真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型mainte-nance甲基转移酶，另一种是 从头合成denovo synthesis甲基转移酶。前者主要在甲基化母链模板链指点下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。日常型甲基转移酶经常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而

3、I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。 由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丧失，所以，高等真核生物中CG序列远远低于其实际值。哺乳类基因组中约存在4万个CG islands，大多位于转录单元的5区。 没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就能够被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。曾经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用, 它就变为T, 无法被区分。因此, CpG序列极易丧失。 2甲基化抑制基因转录的机制甲基化抑制基因转录的机制 甲基化导致某些区域甲基化导致某些区域DNA构象变化，构象变化，从而影响了蛋白质与从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑的相

4、互作用，抑制了转录因子与启动区制了转录因子与启动区DNA的结合效率。的结合效率。 对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全失去转录活性。当这类启动子被加强时，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较高时，即使加强后的启动子仍无转录活性。 由于甲基化对转录的抑制强度与MeCP1methylCpG-binding protein1结合DNA的才干成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决议了该启动子能否具有转录活性。DNA甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。随着个体发育，当需求某些基因坚持沉默时，它们将迅速被甲基化，假设需求恢复转录活性，那么去甲基化。I DNA甲基化抑制基因

5、转录的直接机制某些转录因子的结合位点内含有CpG序列，甲基化以后直接影响了蛋白质因子的结合活性，不能起始基因转录。II. 甲基化抑制转录的间接机制CpG甲基化，经过改动染色质的构象或者经过与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合。 与不含甲基化的染色质相比，甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，阐明甲基化与非甲基化DNA在构象上有差别。曾经分别纯化了数个与甲基化DNA特异结合的蛋白质。MeCP1可以与至少12个对称的甲基化CpG结合，而MeCP2仅同单个甲基化的CpG序列结合。 3DNA甲基化与甲基化与X染色体失活染色体失活 雌性胎生哺

6、乳类动物细胞中两条雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只需之一在发育早期随机失活，以确保其与只需一条一条X染色体的雄性个体内染色体的雄性个体内X染色体基因的剂染色体基因的剂量一样。一旦发生量一样。一旦发生X染色体失活，使该细胞染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都坚持同一条有丝分裂所产生的后代都坚持同一条X染色染色体失活。体失活。 科学家发现，在X染色体上存在一个与X染色体失活有亲密联络的中心部位称为X染色体失活中心X-chromosome inactivation center，Xic，定位在Xq13区正好是Barr氏小体浓缩部位。 Xi-spec

7、ific transcript (Xist)基因只在失活的X染色体上表达，其产物是一功能性RNA，没有ORF却含有大量的终止密码子。实验证明，Xist RNA分子能能够与Xic位点相互作用，引起后者构象变化，易于结合各种蛋白因子，最终导致X染色体失活。二、二、 蛋白质磷酸化与基因表达蛋白质磷酸化与基因表达 蛋白质的磷酸化反响是指经过酶促反响把蛋白质的磷酸化反响是指经过酶促反响把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程的过程,是生物体内存在的一种普遍的调理方式，是生物体内存在的一种普遍的调理方式，在细胞信号的传送过程中占有极其重要的位置。在细胞信号的

8、传送过程中占有极其重要的位置。 曾经发如今人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移究竟物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。 1 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用(1). 在胞内介导胞外信号时具有专注应对特点。与在胞内介导胞外信号时具有专注应对特点。与信号传送有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，信号传送有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如如cAMP，Ca2+，DG二酰甘油，二酰甘油，diacyl glycerol

9、等，这种共价修饰调理方式显然比变等，这种共价修饰调理方式显然比变构调理较少受胞内代谢产物的影响。构调理较少受胞内代谢产物的影响。 (2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶酶“活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反响。式能对外界刺激做出更迅速的反响。(3).对外界信号具有级联放大作用；对外界信号具有级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的继续反响。号的继续反响。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪被磷

10、酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也能够被磷酸化。氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也能够被磷酸化。2. 真核细胞主要跨膜信号转导途径真核细胞主要跨膜信号转导途径 3. 蛋白激酶的种类与功能蛋白激酶的种类与功能 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类：类可分为三大类： 第一类为丝氨酸第一类为丝氨酸/苏氨酸型。这类蛋白激酶苏氨酸型。这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化化第二类为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的第二类为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸残基。酪氨酸残基。第三类是第三

11、类是双重底物特异性蛋白激酶双重底物特异性蛋白激酶dual-specificity protein kinase，既可使丝，既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化。基磷酸化。 根据能否有调理物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶messenger-dependent protein kinase，包括胞内第二信使或调理因子依赖性蛋白激酶及激素生长因子依赖性激酶两个亚类； 非信使依赖型蛋白激酶。4. 受受cAMP调控的调控的A激酶激酶 被被A激酶磷酸化的蛋白质其激酶磷酸化的蛋白质其N端上游往端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特异往存在两

12、个或两个以上碱性氨基酸，特异氨基酸的磷酸化氨基酸的磷酸化X-Arg-Arg-X-Ser-X改改动了这一蛋白的酶活性。这一酶活性代表动了这一蛋白的酶活性。这一酶活性代表了绝大多数细胞中了绝大多数细胞中cAMP所引起的全部反响。所引起的全部反响。PKA全酶由全酶由4个亚基组成个亚基组成(R2C2包括两个包括两个一样的调理亚基一样的调理亚基R和两个一样的催化亚和两个一样的催化亚基基C。全酶的分子量为。全酶的分子量为150-170kD。 C亚基具有催化活性，R亚基具有调理功能，有两个cAMP结合位点。R亚基对C亚基具有抑制造用，所以，R和C聚合后的全酶R2C2无催化活性。R亚基与cAMP的结合导致C亚

13、基解离并表现出催化活性。 激素与其受体在肌肉细胞外外表相结合，诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，再将活化磷酸基团传送给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供ATP。5. C激酶与激酶与PIP2、IP3和和DAG 磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸二磷酸PIP2的两个酶解的两个酶解 产物：肌醇产物：肌醇1，4，5-三磷酸三磷酸IP3和二酰基甘油和二酰基甘油DAG。C激酶激酶PKC是依赖于是依赖于Ca2+的蛋白质激酶。由于的蛋白质激酶。由于IP3所引起的细胞质所引起的细胞质Ca2+浓度升高，导致浓

14、度升高，导致C激酶从胞激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处，并被质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和和Ca2+的双重影响所激活。的双重影响所激活。 C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，缘由是后激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，缘由是后者大大提高了者大大提高了C激酶对于激酶对于Ca2+的亲和力，从而使的亲和力，从而使得得C激酶能被生理程度的激酶能被生理程度的Ca2+离子所活化。离子所活化。C激激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化构造域和一个调理结域。一个催化构造域和一个调理结域。6. CaM激酶及激酶及MAP激酶激酶 Ca2+的细胞学功能主

15、要经过钙调蛋白激酶的细胞学功能主要经过钙调蛋白激酶CaM-kinase来实现，它们也是一类丝氨酸来实现，它们也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，但仅应对于细胞内苏氨酸激酶，但仅应对于细胞内Ca2+程度。程度。MAP激酶激酶mitogen-activated proteinkinase, MAP-kinase，又称为，又称为extracellular-signal-regulated kinase，ERKS活性受许多外源活性受许多外源 细细胞生长、分化因子的诱导，也遭到酪氨酸蛋白激胞生长、分化因子的诱导，也遭到酪氨酸蛋白激酶及酶及G蛋白受体系统的调控。蛋白受体系统的调控。MAP-激酶的活性取激酶的活性取

16、决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基能否都被磷酸化。科学家把能同时催化氨酸残基能否都被磷酸化。科学家把能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为MAP-激酶激酶-激激酶，它的反响底物是酶，它的反响底物是MAP激酶。激酶。MAP-激酶激酶-激酶激酶本身能被本身能被MAP-激酶激酶-激酶激酶-激酶所磷酸化激活，后激酶所磷酸化激活，后者能同时被者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等蛋白等激活，从而在信息传导中发扬功能。激活，从而在信息传导中发扬功能。7. 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 对

17、于许多生长因子受体的研讨阐明，跨膜的对于许多生长因子受体的研讨阐明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传送过程中起着重酪氨酸蛋白激酶在信息传送过程中起着重要作用。表皮生长因子要作用。表皮生长因子EGF、胰岛素、胰岛素样生长因子样生长因子IGF、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子FGF、神经生长因子、神经生长因子NGF、血小、血小板衍生生长因子板衍生生长因子PDGF和血管内皮细胞和血管内皮细胞生长因子生长因子VEGF受体都拥有定位于胞内受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。 具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine

18、 kinase, RPTK)。包括三个构造域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和衔接这两个区域的跨膜构造。胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合的构造根底。 跨膜构造区：是衔接受体细胞内、外两部分，镶嵌在细胞膜中的构造，在接近膜内侧C端经常是由碱性氨基酸构成簇状构造。胞内活性区：保守性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸，能够是RPTK活性的功能的调理部位。第二部分为活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性。该区含有ATP结合位点

19、和底物结合位点，能够是不同类型RPTK底物特异性的决议区域。第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性构造，具有高度的可塑性。 没有Cyclin，CDK无活性。 Cyclin的合成和积累。 构成Cyclin和CDK复合物。Tyr磷酸化妨碍了ATP的结合，CDK依然无活性。 T-环中的Thr被磷酸化，Tyr上的磷酸基团被去掉，CDK活性大为加强。 CDK使磷酸酯酶磷酸化，进一步提高其活性。 CDK使DBRP磷酸化，具有酶活性。 在DBRP的协助下，泛素衔接酶把泛素加到Cyclin上。 Cyclin被降解，CDK失活。见Lehninger, figure

20、13-33。 CDK经过蛋白质磷酸化过程控制细胞分裂。没有被磷酸化的PRb能与转录因子E2F相结合并使后者不能激活一系列与DNA合成有关的酶，导致细胞无法由G1进入S。 erbB原癌基因其实编码了一个突变的EGF受体蛋白，它的胞内激酶活性区被永久性激活相当于EGF到正常EGF受体上。因此，erbB导致了细胞的永久型分裂。8. 蛋白磷酸酯酶蛋白磷酸酯酶 Ser/Thr蛋白磷酸酯酶主要包括：蛋白磷酸酯酶主要包括：PP-1，PP-2A，PP-2B和和PP-2C四类。四类。 PP-1是糖代谢中的一个关键酶，具有很高的活性，是糖代谢中的一个关键酶，具有很高的活性，其催化亚基为其催化亚基为38kDa，可以

21、与其它组分或调理亚，可以与其它组分或调理亚基组成全酶。基组成全酶。PP-2A全酶包括一个全酶包括一个36kDa的催化的催化亚基和一个亚基和一个65kDa的调理亚基。的调理亚基。PP-2B是目前所是目前所发现的独一受发现的独一受Ca和和CaM调理的蛋白磷酸酶调理的蛋白磷酸酶,催化催化了磷酸化酶激酶了磷酸化酶激酶亚基的脱磷酸化作用。由亚基的脱磷酸化作用。由61kDa的的A亚基和亚基和16kDa的的B亚基组成。亚基组成。A为催化亚基。为催化亚基。PP-2C的分子量为的分子量为43-48kDa，其活性需求，其活性需求mmol/L程度的程度的Mg2+，现对其参与调理的生理过，现对其参与调理的生理过程知之

22、甚少。程知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶PTP主要有:胞内型，跨膜受体型。两类PTP的共同点是它们 的催化域中氨基酸顺序极为类似，共有240个氨基酸，内含-HCXGXXRS/TG-的signature motif。胞内型PTP只需一个催化域。受体型中常有两个催化区，其不同类型的胞外构造往往不同。PTP1B胞内型是一个37kDa的胞内酶，在氨基酸程度上与CD45跨膜受体型的胞内部分有很高的同源性。 CD45是一类在构造上相关的，高分子量150-280kD跨膜蛋白，具有与受体极为类似的构造特点，在免疫T细胞和B细胞中含量极高。 9.蛋白质磷酸化与基因表达蛋白质磷酸化与基因表达 处于信号传送链终端的蛋白

23、质磷酸化处于信号传送链终端的蛋白质磷酸化既能对许多酶蛋白及生理代谢过程起直接既能对许多酶蛋白及生理代谢过程起直接的调理作用，又能经过使转录因子磷酸化的调理作用，又能经过使转录因子磷酸化来调理基因活性。来调理基因活性。a. 对转录因子核定位的调理对转录因子核定位的调理 SV40抗原未磷酸化时存在于胞质，其抗原未磷酸化时存在于胞质，其111和和112位残基被酪蛋白激酶位残基被酪蛋白激酶IICKII磷磷酸化后，其分子内的核转位信号构造域酸化后，其分子内的核转位信号构造域(nuclear transport signal，NTS)变构而变构而易于进入细胞核发扬作用。易于进入细胞核发扬作用。 转录因子S

24、WI5只在G1期存在于细胞核内，激活核酸内切酶基因转录。在其它时期那么以磷酸化的方式存在于细胞质中。CdC2使其核转位信号构造域附近的3个Ser残基磷酸化，使之无法进入核内，失去激活基因转录功能。 有时转录因子上存在一种抑制构造R，掩盖了它的NTS功能区， 从而不能进入核内；磷酸化使该区暴露，从而易于进入核内。有时，非磷酸化形状下转录因子与胞质锚定或抑制亚基结合，掩盖其NTS构造使之不能进入核内。当转录因子本身或者其抑制亚基被磷酸化，使NTS构造暴露，进入核内发扬功能。转录因子NF-KB常与IKB结合成复合体存在于胞质中。只需在被各种刺激因子或佛波脂PKC激活剂作用后IKB磷酸化并与NF-KB解离，后者才干进入核内。b. 对转录因子DNA结合活性的调理 转录因子上的DNA结合构造域DBD或其附近残基被磷酸化后，由于负电荷添加而减弱了转录因子DBD和DNA序列的静电相互作用。 静止态细胞中，AP-1复合体中转录因子c-Jun DBD附近的3个氨基酸残基Thr231，Ser243和Ser249被Gsk-3和CKII磷酸化，不能与DNA结合。遭到生长因子等刺激时，