3-基因工程制药技术(2)

1、第二章 基因工程制药技术获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌培养工程菌产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定成品检定成品检定包装包装制备基因工程药物的一般程序制备基因工程药物的一般程序上游阶段上游阶段下游阶段下游阶段 基因基因工程菌构建流程工程菌构建流程一一 表达载体构建表达载体构建l 表达载体设计l 目标基因的定位克隆l 酶切反应l 连接反应l 转化l 筛选与鉴定1.1.表达载体的设计表达载体的设计l表达载体概念：expression vector在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所

2、构成。l外源基因表达盒(操纵子模型)：2 2、目标基因、目标基因PCRPCR定位克隆定位克隆PCR循环循环PCR扩增的反应体系组成扩增的反应体系组成l模板DNA：目标序列,10010 000bp,pgl引物：两条寡核苷酸，2127 bp。l脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPlDNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高温l缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl,1.5 mM MgCl23.3.酶切反应酶切反应和连接反应和连接反应限制性核酸内切酶连接酶4.4.转化、转化、筛选与鉴定筛选与鉴定非转化子：没有导入外源非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细

3、胞的非转化宿主细胞转化子：导入外源转化子：导入外源DNA的转化细胞的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组重组子：含有重组DNA分子的转化子分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）非目标重组子：不含目的基因重组子非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞类型转化后的细胞类型筛选方法l将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩阳性克隆并加以扩增。增。 所用的方法主要有所用的方法主要有遗传学方法、免疫遗

4、传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、学方法、核酸杂交法、PCR等。等。（1） 遗传学方法遗传学方法 A. 抗生素筛选法抗生素筛选法 a. 单抗生素筛选单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（素（ampicillin, Amp）、）、四环素四环素(tetracycline,Tet)、卡卡那霉素那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。带有完整抗生素基抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。琼脂平板上生长。 b. 双抗生素筛选双

5、抗生素筛选双抗生素筛选结果示意图双抗生素筛选结果示意图 B. 蓝蓝-白筛选（白筛选（互补）互补） 许多载体（如许多载体（如M13系列、系列、pUC系列、系列、pGEM系列）都含有系列）都含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端的调控序列和氨基端145个氨个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶

6、学活性的蛋白质。这种现象称为可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互互补。补。 因此，当载体的多克隆位点没有插入外源因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNADNA片段时，片段时，互补能正常进行，产生有活性的互补能正常进行，产生有活性的-半半乳糖苷酶。乳糖苷酶。 能使人工底物能使人工底物X-galX-gal变成蓝色变成蓝色, , 产生产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源外源DNADNA片段，导致产生无片段，导致产生无互补能力的氨基端片互补能力的氨基端片段段, , 带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。

7、（2） 免疫学方法免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。行筛选。（3） 核酸杂交法核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。基因是否表达。菌落原位杂交

8、菌落原位杂交的原理的原理 鉴定方法 菌落PCR：是否含有目标基因 载体大小：电泳检测 酶切鉴定：插入片段大小及插入方向 测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读二二 基因工程菌的构建基因工程菌的构建 基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。 基因工程菌种类： 细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。1.1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统细胞：细胞：G，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落菌落:白色至黄白色，光滑，直径白色至黄白色，光滑，直径23mm。 大肠杆菌表

9、达系统是大肠杆菌表达系统是发展最早、应用最广泛的经典的表达系统发展最早、应用最广泛的经典的表达系统优点： 遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70），培养周期短，抗污染能力强缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达 细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热原基因工程大肠杆菌的应用 l 多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）l 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)l 细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮

10、抗剂l 溶栓酶类：rPAl 白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等PEG 聚乙二醇（PEG）是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相容性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。 具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，能 防止肾小球滤过 减少免疫原性 阻止蛋白酶降解2.2. 酵母表达系统酵母表达系统细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色

11、，有光泽，边沿整齐。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。优点：安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。基因工程酵母的应用 1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素l 激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素；细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子l 多肽类：高血糖素l 2种乙肝疫苗等。水蛭素 水蛭素：从水蛭唾液中提取的天然特效凝血酶抑制剂 天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽化合物，在低于

12、70摄氏度的环境温度下都能保持活性。它溶于水，能够阻止血液中纤维蛋白的凝固，抑制凝血酶与血小板的结合，有极强的溶解血栓作用。 重组水蛭素是用基因工程通过大肠杆菌、噬菌体或酵母菌表达产生，其氨基酸序列和结构与天然水蛭素唯一不同的是其63位酪氨酸残基未硫酸化，该特点使其对凝血酶的抑制作用明显降低，仅为天然水蛭素的1/10。但这种方法能获得相当量的重组水蛭素，所以极大地推动了水蛭素的药理、临床等方面研究工作的深人开展。 三三 基因工程菌基因工程菌的的培养与发酵培养与发酵 （1）培养基组成与控制培养基组成与控制碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐选择剂选择剂诱导物诱导物碳源l 大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物

13、作为碳源l 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。l 添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。l 浓度稍高后就表现出底物抑制作用。l 葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。氮源l 直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。l 不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。l 大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。l 酵母：利用氨基酸为氮源无机盐l 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态l 基因工程菌生长提供必需的矿物质。选择剂选择剂selective agentl 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性

14、的化合物。l 发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌为了保证质粒的稳定性，不丢失，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。诱导物诱导物 诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。 诱导物成为产物表达必不可少的。 Lac启动子表达系统：IPTG诱导。 甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导2.2.培养工艺与控制培养工艺与控制l温度l溶解氧lpH大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45。酿酒酵母生长最适温度为30，最高温度为40。温度对工程菌发酵的影响温度对工程菌发酵的影

15、响两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37，生产期提高温度42。温度控制温度控制pH值对发酵的影响值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.57.5，真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.06.0。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。pH值控制值控制了解发酵过程中各个阶段的适

16、宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。溶解氧控制溶解氧控制工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力考虑溶氧对质粒稳定性的影响：调节搅拌转速和通气量四四 重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺l 概念：（interferon，IFN） 机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子l 功能：干扰病毒在细胞内的繁殖l 天然干扰素分类：I干扰素：IFN、IFN、IFN、IFN、IFNII干扰素：IF

17、Nl 上市重组干扰素: 2a、2b、1b、1b，l 研发中的重组干扰素：IFN ，临床阶段l广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。l直接抗肿瘤活性（rhuIFN）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）l多发性硬化症rhuIFN重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用l体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（1）l1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市l产量低：1g IFN，需要3亿ml人血白细胞l来源困难，工艺复杂，收率低，价

18、格昂贵l潜在的血源性病毒污染的可能性l人源转化细胞系培养生产工艺： 干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（2）l1999年：IFN -n1/Wellferon, 批准用于临床。l优点：首次实现大规模商业化生产。l缺点：活性低，退出临床应用。l基因工程大肠杆菌发酵生产工艺：干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（3）l上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasysl表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体l工艺特点：发酵过

19、程，随后变性、复性过程。干扰素生产工艺路线（4）动物无限细胞系培养生产工艺：l上市产品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)l表达产物：166 aa糖基化蛋白，22.5 kul工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格l宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）l上市产品：IFN -2b/安福隆l表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性l工艺特点：发酵酵期期：个个小无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰体体和和层干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（5）五五 转基因动物技术转基因动物技

20、术主要步骤：主要步骤： 获取外源目的基因 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物 经典的技术路线 目的基因 显微注射显微注射 已交配的 取出取出 移植移植 受体动物 妊娠妊娠供体动物 受精卵 输卵管 转基因动物 缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低受精卵移植的受孕率低。 转基因动物的技术路线转基因动物的技术路线 整合胚胎移植的技术路线 转基因动物 受体动物子宫 目的基因 非手术非手术 胚胎移植胚胎移植 体外受精体外受

21、精 体外培养体外培养 多细胞胚胎 检测检测 整合外源基因卵子 受精卵 或囊胚 的胚胎精子 优点：受精卵的成活率高达优点：受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高，以上，外源基因整合率高，提高受孕率。提高受孕率。 转基因动物的技术路线（续）转基因动物的技术路线（续） 转基因动物的技术路线（续）转基因动物的技术路线（续） 核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物 导入导入 动物胎儿成纤维细胞 妊娠妊娠 取核取核 动物 去核去核 重组的 体外培养体外培养 囊胚期 胚胎移植胚胎移植 卵细胞 受精卵 胚胎 受体动物子宫 特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。特点：体细胞核移植；核移植前导入

22、目的基因。转基因动物的技术路线（续）转基因动物的技术路线（续） 整合卵受精的技术路线： 目的基因 转基因动物 导入导入 逆转录病毒 妊娠妊娠 精子 感染感染 体外受精体外受精 胚胎移植胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。 目的基因的制备和转基因的方法目的基因的制备和转基因的方法 目的基因的制备目的基因的获得 逆转录合成法 化学合成法 PCR扩增法目的基因的扩增 通过载体在宿主中克隆 通过PCR扩增目的基因 转基因动物的方法 显微注射法 生殖细胞载体法 胚胎干细胞法 病毒载体法 显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵

23、，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于1%）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。 生殖细胞载体法 有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，在经杂交育种可得到