DNA琼脂糖凝胶电泳ppt课件

1、DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实实 验验 二二学时：学时：3 31 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分别核酸的、掌握琼脂糖凝胶电泳分别核酸的原理和方法。原理和方法。2 2、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。 一、实验目的：一、实验目的： 一电泳技术：一电泳技术： 1 1、电泳定义：是指带电粒子在电场中、电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其本身所带电荷相反的电极方向挪动的向与其本身所带电荷相反的电极方向挪动的景象。景象。 根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术

2、的运用非常广泛，从凝胶电泳等。电泳技术的运用非常广泛，从分别小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到分别小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分别鉴定都依赖于电泳技术。的分别鉴定都依赖于电泳技术。二、实验原理二、实验原理: 1带电颗粒的大小和外形：颗粒越大，电泳速度带电颗粒的大小和外形：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；越慢，反之越快；2颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；之越快；3 溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；越快；

3、4溶液的溶液的pH值：影响被分别物质的解离度，离等值：影响被分别物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电点越近，电泳速度越慢，反之越快； 2 2、影响电泳的主要要素：、影响电泳的主要要素： 5电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；之越快；6离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；之越快；7电渗景象：电场中，液体相对于固体支持物的电渗景象：电场中，液体相对于固体支持物的相对挪动；相对挪动；8支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之那么快。那么快。

4、l琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分别方法，是一种简便、快速分别鉴定核酸的方法，已泳分别方法，是一种简便、快速分别鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研讨中常用实验方法之一。成为分子生物学及基因工程研讨中常用实验方法之一。l琼脂糖英文名琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和乳糖和3.6-脱水脱水- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可构成多孔的凝胶，电泳琼脂都可在不同浓度的水溶液下可构成多孔的凝胶，电泳中具有分子

5、筛效应。中具有分子筛效应。二琼脂糖凝胶电泳分别核酸的原理：二琼脂糖凝胶电泳分别核酸的原理：lDNADNA分子在分子在pHpH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极挪动电荷效应中向正极挪动电荷效应 。lDNADNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNADNA分子的带电量有关外，分子的带电量有关外，还与还与DNADNA分子的大小和空间构象有关琼脂糖凝胶的分子分子的大小和空间构象有关琼脂糖凝胶的分子筛效应。筛效应。l电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，指示电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，指示DNADNA样品在凝胶样品在凝胶中确实切位置。中确实切位置。l溴

6、乙啶是一种荧光染料，可插入溴乙啶是一种荧光染料，可插入DNADNA双螺旋构造的两个双螺旋构造的两个碱基对之间，与碱基对之间，与DNADNA分子构成络合物，在紫外光的激发下分子构成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。这次实验运用溴乙啶替代品发出橙黄色的荧光。这次实验运用溴乙啶替代品DNAgreenDNAgreenDNAgreen核酸染料vDNAgreen是一种花箐类染料，具有平安、灵敏作为各种核酸电泳的染色剂。vDNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm还有一个吸收峰，与核酸结合后发射绿色荧光，因此在紫外凝胶透射仪上可以检测出DNA样品。v作为EB的一种替代品。1

7、核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分别的关系核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分别的关系 凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小成反比分子大小成反比( 20kb) ，因此经过知大小的规范物挪动的间隔与未知片段的，因此经过知大小的规范物挪动的间隔与未知片段的挪动间隔时行比较，便可测出未知片段的大小。挪动间隔时行比较，便可测出未知片段的大小。2核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分别的关系核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分别的关系 不同构型不同构型DNA的挪动速度次序为：闭环的挪动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能不能进

8、入胶中进入胶中)。3不同大小的不同大小的DNA需求用不同浓度的琼脂糖凝胶进展电泳需求用不同浓度的琼脂糖凝胶进展电泳分别。分别。琼脂糖浓度琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状线状DNA大小大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：注：DNA片段在片段在5-500bp之间时，普通用聚丙烯酰胺凝胶电之间时，普通用聚丙烯酰胺凝胶电泳泳PAGE进展电泳分别。进展电泳分别。三琼脂糖凝胶电泳分别核酸的影响要素三琼脂糖凝胶电泳分别核酸的影响要素1 1操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度操作简单、制备容易快速

9、、凝胶机械性能好、电泳速度快、分别快、分别DNADNA片段范围广、样品不需事先处置就可以进展电泳。片段范围广、样品不需事先处置就可以进展电泳。2 2凝胶构造均匀，对样品吸附小，电泳图谱明晰，分辨率凝胶构造均匀，对样品吸附小，电泳图谱明晰，分辨率高，反复性好。高，反复性好。3 3琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。光检测及定量测定。4 4电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保管。成干膜可长期保管。因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研因此

10、，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研讨中常用实验方法之一，讨中常用实验方法之一， DNADNA样本的分别、纯化、鉴定以及样本的分别、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。四琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：四琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：DNA Marker 荧光染料荧光染料EB染色后，染色后，在紫外灯在紫外灯(305nm)下下察看到的电泳结果：察看到的电泳结果：1 1、实验资料：提取的小麦苗中的、实验资料：提取的小麦苗中的DNADNA2 2、仪器：、仪器： (1) (1)稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 (2) (2)可调微量移液器可调微量移液器

11、(3) (3)程度电泳槽程度电泳槽 4 4暗箱紫外透射仪等。暗箱紫外透射仪等。3 3、试剂：、试剂：1 1电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris-Tris-硼酸硼酸EDTAEDTA5050TBETBEpH8.3pH8.3。2 2加样缓冲液：加样缓冲液：0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝BPBBPB，40%40%蔗糖，蔗糖，DNAgreenDNAgreen。 (4) (4)琼脂糖凝胶：浓度为琼脂糖凝胶：浓度为0.7%0.7%。 三、实验资料、仪器和试剂：三、实验资料、仪器和试剂：1 1、凝胶板的制备：、凝胶板的制备：1 1取琼脂糖取琼脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE缓冲溶液缓冲溶液10

12、0ml100ml，于沸水浴中至熔化，制成，于沸水浴中至熔化，制成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。的琼脂糖胶液。2 2胶床两头贴上防水胶带，构成胶床两头贴上防水胶带，构成8mm8mm高的挡墙，压紧胶带，置程度台面高的挡墙，压紧胶带，置程度台面上。上。3 3插入梳子，梳齿下端离板底插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51mm1mm。4 4当琼脂糖胶液温度降到当琼脂糖胶液温度降到6060的时候的时候, ,将将6060凝胶不延续倒入胶床，高凝胶不延续倒入胶床，高3 34mm4mm，防止产生气泡，室温下凝固。，防止产生气泡，室温下凝固。5 5完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，参与电泳缓冲液，高于胶完全凝固

13、后，撕掉胶带，置于电泳槽中，参与电泳缓冲液，高于胶面面1 12mm2mm，从一头悄然斜拉，从一头悄然斜拉 梳子，除去产生的气泡。梳子，除去产生的气泡。四、实验步骤：四、实验步骤： 3 3、加样：、加样： 将样品将样品DNADNA溶液与加样缓冲液以溶液与加样缓冲液以5 5 ：1 1的体积比混合，用的体积比混合，用微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量151520 20 l l 加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部。凝胶底部。4 4、电泳：、电泳： 为了获得电泳分别为了获得电泳分别DN

14、ADNA片段的最大分辨率，电场强度不片段的最大分辨率，电场强度不应高于应高于5V/cm5V/cm两电极间的间隔开场时用较高电压两电极间的间隔开场时用较高电压(80V)(80V)，样品一进入胶内那么将电压调至样品一进入胶内那么将电压调至5V/cm 5V/cm 。当染料前沿移至底。当染料前沿移至底边边1-2mm1-2mm时，电泳毕。时，电泳毕。5 5、染色、察看、显微照相与记录：、染色、察看、显微照相与记录： 封锁电源，取出胶床，浸入封锁电源，取出胶床，浸入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶液中，溶液中，30min30min后取出。在紫外检测仪下察看凝胶中的后取出。在紫外检测仪下察看凝胶中

15、的DNADNA红橙色荧红橙色荧光，并进展显微照相。最后要求绘制光，并进展显微照相。最后要求绘制DNADNA电泳图谱。电泳图谱。五、思索题：五、思索题： 影响电泳的主要要素影响电泳的主要要素? ? * * 荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。 EBEB是一种扁平分子，它可是一种扁平分子，它可以嵌入核酸相邻的碱基之间，在紫外线激发下，发以嵌入核酸相邻的碱基之间，在紫外线

16、激发下，发出红橙色荧光。它与出红橙色荧光。它与DNADNA的结合几乎没有碱基序列的结合几乎没有碱基序列特异性。特异性。 溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致溴化乙锭嵌入碱基分子中，导致DNADNA在复制过程在复制过程中错配中错配 。所以溴化乙锭是一种强诱变剂，具有高致癌性。在实所以溴化乙锭是一种强诱变剂，具有高致癌性。在实验过程一定要带上手套！验过程一定要带上手套！ 2 2、优点：、优点：1 1染色比较简便、快捷，普通在染色比较简便、快捷，普通在101015min15min就可反响。就可反响。2 2EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做料所不能做 到的。到的

17、。3 3EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。4 4既可用于既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。5 5EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。6 6EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离发出的荧光比游离的的EBEB强强1010倍，倍， 因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。3 3、缺陷：、缺陷： 溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能配制试剂时应