液相增加柱效提高灵敏度的小诀窍

1、1液相增加柱效、提高灵敏度的小诀窍 资料收集：资料收集：2生化生化 多肽多肽- 5988-6316EN升温对于反相升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响分离强疏水肽的影响 (B27)Polypeptide流动相流动相: A: 含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2% B / min进样量进样量: 100L (50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV: 210 nm流速流速: 1 mL/min室温室温液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室温室温300C400C50

2、0C600C700C提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）3环保环保样品样品: 除草剂除草剂流动相流动相: 52/48 0.1 M乙酸乙酸钠钠/甲醇甲醇, pH 6流速流速: 0.45 mL/min温度温度: 40, 90检测检测: UV除草剂除草剂: 柱温的影响柱温的影响Herbicides: Effect of Column Temperature1. 西玛津西玛津2. 敌草隆敌草隆3. 扑灭津扑灭津4. 扑灭净扑灭净5. 异丙甲草胺异丙甲草胺1. Simazine2. Diuron3. Propazine4. Prometryn5. etolachlor液相

3、色谱柱液相色谱柱: Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m4090提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）4生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax 300 StableBond-C3色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 肽类肽类/蛋白质蛋白质: 升温对分离的影响升温对分离的影响Peptides/Proteins: Effect of Elevated Temperature样品样品: 多肽多肽 流动相流动相: A = 5: 95, 乙腈乙腈 : 水水, 0.10%三氟乙酸三

4、氟乙酸 (V/V%)B = 95: 5, 乙腈乙腈 : 水水, 0.085%三氟乙酸三氟乙酸 (V/V%)梯度梯度: 在在 20 min内内 15-53%, 后运行时间后运行时间 12 min流速流速: l.0 mL/min 温度温度: 室温室温 -60检测检测: UV 215 nm1. 亮氨酸脑啡呔亮氨酸脑啡呔 2. 血管紧张素血管紧张素II 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶A 4. 牛胰岛素牛胰岛素 5. 细胞色素细胞色素C 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 肌红蛋白肌红蛋白 8. 碳酸酐酶碳酸酐酶1.Leucine Enkephalin2. Angiotensin II3. Rnase A4. Ins

5、ulin(BOV)5. Cytochrome C6. Lysozyme7. Myoglobin8. Carbonic anhydrase提高柱温，提高柱温，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）5生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 150 mm, 5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度Reducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samples流动相流动相: 60%乙腈乙腈/

6、40%水水流速流速: 内径内径 0.3 mm-4 uL/min内径内径 0.5 mm-10 uL/min内径内径 1.0 mm-50 uL/min内径内径 4.6 mm-1.0 uL/min温度温度: 室温室温检测器检测器: UV 254 nm样品样品: 200 ng联二苯联二苯 (100 nl) 减小柱径，可增减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）6色谱柱技术色谱柱技术 5988-6454EN使用小体积色谱柱对于检测器使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性响应时间的重要性 (TE32)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:

7、 4.6 x 15 mm 3.5m流动相流动相: 乙腈乙腈: 1%甲酸甲酸=32: 68UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min. 30C进样量进样量: 5 L响应时间响应时间: 4.0秒秒响应时间响应时间: 2.0秒秒响应时间响应时间: 1.0秒秒响应时间响应时间: 0.5秒秒响应时间响应时间: 0.1秒秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide缩短检测器响应时间缩短检测器响应时间，可增加柱效，可增加柱效 （提高灵敏度）提高灵敏度）7色谱柱技术色谱柱技术 ：不同硅胶类

8、型比较：不同硅胶类型比较 (TE1)流动相流动相: 含含0.05%甲醇的二氯甲甲醇的二氯甲烷烷 液相色谱柱液相色谱柱toluenebenzanilidephenolbenzyl alcoholZorbax SilSpherisorbZorbax Rx-Sil甲苯甲苯N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺苯酚苯酚苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）8有机化学有机化学 5988-6366ENpH对苯胺取代物分析的影响对苯胺取代物分析的影响 (ORCH1)流动相流动相25mM磷酸磷酸: 甲醇甲醇=58: 42 流速流速: 1 mL/min 22C液相色谱柱液相色

9、谱柱: ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺间位苯甲胺间位苯甲胺3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈对位氯苯胺对位氯苯胺间位氯苯胺间位氯苯胺邻位氯苯胺邻位氯苯胺pH: 2.5pH: 7.0改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）9生化生化 肽肽 5988-6293EN三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响 (B10)Peptide流动相流动相: A: 水和三氟乙酸水和三氟乙酸B: 乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0 - 30% B （30 min.内）内）流

10、速流速: 1 mL/minUV: 254 nm进样量进样量: 6uL十肽菌素标样十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异）（疏水性有略微差异）40C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX 300 SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）10食品分析食品分析 5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离的影响流动相强度对单糖和二糖分离的影响 (FD4)流动相流动相: 乙腈乙腈/水如图水如图流速流速: 1 mL/min示差折

11、光检测器示差折光检测器液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX NH2 色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m果糖果糖葡糖葡糖蔗糖蔗糖Palatinose海藻糖海藻糖异麦芽糖异麦芽糖乙腈乙腈/水水70/30乙腈乙腈/水水75/25 改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）11色谱柱技术色谱柱技术 5988-6468EN有机改性剂和有机改性剂和pH对于选择性的影响对于选择性的影响 (TE5)流动相流动相: 25 mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速: 1.0 mL/min.22C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-CN色谱柱尺寸色谱

12、柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5manisidinem-toluidine4-cl-aniline3-aminobenzonitrile3-cl-aniline2-cl-aniline甲氧基苯胺甲氧基苯胺间位苯甲胺间位苯甲胺4-氯氯-苯胺苯胺3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈3-氯氯-苯胺苯胺2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇 ：58%缓冲液缓冲液 30%甲醇甲醇 ：70%缓缓冲液冲液pH 2.6pH 3.0改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）12色谱柱技术色谱柱技术 5988-6453ENZORBAX Eclipse系列色谱柱系列色谱柱的选择性的选择性 (TE3

13、1)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m流动相流动相: 甲醇甲醇 : 水水=70: 30UV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.室温室温Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改变键合相，改变键合相，可增加柱效

14、可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）13生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax Extend-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLCESI-MS分离的选择性比较分离的选择性比较Selectivity Comparison of TFA and NH4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速: 0.25 mL/min. 温度温度: 25 梯度梯度: 5-60% B in 20 min.LC/MS: 正离子正离子, ESI- Vf 70V, Vcap

15、 4.5 kV, N2- 35 psi, 12 L/min., 300样品样品: 4L (各各50 ng)三氟乙酸条件三氟乙酸条件: A- 0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80%的乙腈溶的乙腈溶液液NH4OH条件条件: A- 20 mM NH4OH水溶液水溶液B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈的乙腈溶液溶液改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）14生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN酸对于反相肽的分离的影响酸对于反相肽的分离的影响(B16)decapeptide液相色谱柱液相色谱柱: Z

16、ORBAX 300 SB-C8 色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m十肽菌素十肽菌素 S1十肽菌素十肽菌素 S2十肽菌素十肽菌素 S3十肽菌素十肽菌素 S4十肽菌素十肽菌素 S5decapeptide S1 decapeptide S2 decapeptide S3 decapeptide S4 decapeptide S50.1% 三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H3PO4改变有机添加剂改变有机添加剂可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）流动相流动相: A: 含相应的酸的水相含相应的酸的水相 B: 含相应的酸的乙腈含相应的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.

17、内）内）进样量进样量: 6L肽标样肽标样UV: 254 nm流速流速: 1 mL/min40C15色谱柱技术色谱柱技术 流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5mUV: 254 nm流速流速: 1 mL/ min.室温室温UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthalateAcenaphthene尿嘧啶尿嘧啶尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯萘萘二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix A: 水水 B: 甲醇甲醇, 用泵