第6章RNA剪切加工ppt课件

1、第第6 6章章 RNARNA剪切加工剪切加工 多数转录的初始产物无生物活性，在生物体内进行加工处理后才具有生物活性。转录后加工post-transcriptional modification） （ post-transcriptional processing）: 是指将各种前体RNA分子加工转变成有功能的、成熟的各种RNA(mRNA、rRNA或tRNA等) 的过程 加工的三种形式是：加工的三种形式是： 减少部分片段：如切除减少部分片段：如切除5端端前导序列，前导序列，3端尾巴和中部的内端尾巴和中部的内含子；含子； 增加部分片段：增加部分片段：5加帽加帽,3加加ploy(A)和通过编辑加入一

2、些和通过编辑加入一些碱基；碱基； 修饰：对某些碱基进行甲基化修饰：对某些碱基进行甲基化等等o原核生物tRNA和rRNA加工o真核生物tRNA和rRNA加工1.1 tRNA 1.1 tRNA 和和 rRNA rRNA 的加工的加工1.1.1 tRNA1.1.1 tRNA加工加工 原核生物原核生物tRNAtRNA初始转录本有三种初始转录本有三种（1 1多数为串连在一起的多顺反多数为串连在一起的多顺反polycistronpolycistron）（2 2少数为单顺反子少数为单顺反子（3 3由由tRNAtRNA和和rRNArRNA串连组成串连组成原核生物原核生物tRNAtRNA和和rRNArRNA的加

3、工的加工原核生物有两种类型的原核生物有两种类型的tRNAtRNA基因：基因： 1 1、具、具CCACCA序列序列 型型tRNA tRNA CCA CCA下游仍有一段序列，需下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除在酶的作用下切除 2 2、无、无CCACCA序列序列 型型tRNA tRNA 需在酶的作用下添加需在酶的作用下添加CCACCA序序列列（1RNaseP (由蛋白质和RNA组成的复合体)可切除E.coli前体tRNA 5的前导序列41nt）。该酶不识别特殊的序列，而是识别二级结构发夹所组成的tRNA。（2去尾，形成3OH末端。由内切酶和外切酶共同参与。2. rRNA2. rRNA的加工的加工

4、 在在E.coliE.coli中中rRNArRNA有有7 7个转录单位个转录单位, ,每个转每个转录单位含有录单位含有16S16S、23S23S、5S rRNA 5S rRNA 及一个或及一个或几个几个tRNAtRNA。 rRNA rRNA前体的加工由前体的加工由RNase RNase 负责。负责。真核生物真核生物 tRNA tRNA 和和 rRNA rRNA的加工的加工 1. tRNA的加工 真核tRNA的基因与原核不同： 1真核的前体分子tRNA数目多、单顺反子、成簇排列、有基因间隔区。 例如：爪蟾 tRNA基因数目200拷贝，酵母约有400个tRNA基因，是一种重复序列； 2真核的前体分

5、子 tRNA中含有内含子。 其加工过程要剪接内含子，都要加CCA tRNA半分子tRNA半分子半分子真核真核tRNAtRNA内含子的切除和其他内含子的切内含子的切除和其他内含子的切除是不同的：除是不同的： 1 1没有交界序列，没有内部引导序列没有交界序列，没有内部引导序列; ; 2 2切除是依赖于蛋白质的切除是依赖于蛋白质的RNase;RNase; 3 3不是转酯反应；不是转酯反应； 4 4其剪切原则上是依赖于对其剪切原则上是依赖于对tRNAtRNA共共同的二级结构的识别。同的二级结构的识别。 2. 2.真核真核rRNArRNA的加工的加工 真核生物的真核生物的18S18S、5.8S5.8S和

6、和28S rRNA28S rRNA基因基因串联在一起形成一个转录本，初级转录本为串联在一起形成一个转录本，初级转录本为45S45S前体，前体，5S RNA5S RNA与它们分开转录，这和原核与它们分开转录，这和原核的的rRNArRNA基因不同。基因不同。 1 1真核真核rRNArRNA基因中没有内含子。基因中没有内含子。 2 2在转录时或转录后有在转录时或转录后有110110个甲基化酶立个甲基化酶立即结合导转录本上：保持到即结合导转录本上：保持到rRNArRNA加工成熟。加工成熟。 18S RNA 18S RNA 结合结合3939个甲基化酶胞质个甲基化酶胞质中加上中加上4 4个）个） 28S

7、RNA 28S RNA 结合结合7474个甲基化酶个甲基化酶 表明甲基化用于标明转录本的加工表明甲基化用于标明转录本的加工区域区域1.2 前体mRNA的加工1.2.1 原核前体mRNA的加工1.2.2 真核前体mRNA的加工1.2.1 原核前体mRNA的加工 原核生物的mRNA一般不经过加工，由于转录和翻译偶联，中间没有加工的时间。 少数情况：多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。 1.2.2 真核mRNA的加工 真核mRNA的加工一般要经过四个步骤： 1mRNA的5端加帽 2mRNA的3端多聚腺苷酸化加尾） 3切除内含子 4修饰对某些碱基进行甲基化） 1.2.2.1 mR

8、NA1.2.2.1 mRNA的的55加帽加帽n成熟的真核生物并没有游离的成熟的真核生物并没有游离的55端，只有所谓的帽子结构，该端，只有所谓的帽子结构，该结构是通过转录加工加上去的。结构是通过转录加工加上去的。nmRNAmRNA的的55加帽是一个多步加工过程，加帽是一个多步加工过程，n 第一步是鸟苷转移酶第一步是鸟苷转移酶guanylyl transferaseguanylyl transferase将一个将一个鸟苷酸加在鸟苷酸加在5 RNA5 RNA的前端，产生的前端，产生5-55-5对接的磷酸二酯键。对接的磷酸二酯键。n 第二步由鸟嘌呤甲基转移酶第二步由鸟嘌呤甲基转移酶quanine me

9、thyl quanine methyl transferase transferase ）将一个甲基基团加到嘌呤环的）将一个甲基基团加到嘌呤环的7 7位氮原子使位氮原子使55帽子鸟嘌呤转变为帽子鸟嘌呤转变为7-7-甲基鸟嘌呤。甲基鸟嘌呤。1.2.2 真核mRNA的加工存在于各类帽子中存在于各类帽子中存在于存在于类帽子中类帽子中存在于存在于类帽子中类帽子中CH3CH3mRNA 5mRNA 5加帽的功能主要表现在加帽的功能主要表现在4 4个方面：个方面：1 1保护保护mRNA5mRNA5端不被降解端不被降解 细胞内存在许多细胞内存在许多RNARNA酶酶RNaseRNase），它们可攻击），它们可攻

10、击游离的游离的RNARNA分子。分子。 RNA RNA酶的降解从酶的降解从55端起始，端起始， 当在当在mRNAmRNA的的55端加上端加上m7GpppGm7GpppG帽子后，带有帽子后，带有3 3个个连接磷酸的连接磷酸的55帽可阻止帽可阻止RNaseRNase切割。切割。2 2为核糖体识别为核糖体识别mRNAmRNA提供信号，提高翻译效率提供信号，提高翻译效率 真核生物真核生物mRNAmRNA必须通过必须通过55帽结合蛋白才能接帽结合蛋白才能接触核糖体，起始翻译。缺少加帽的触核糖体，起始翻译。缺少加帽的mRNAmRNA由于不能由于不能被被55帽结合蛋白识别，其翻译效率比加帽的帽结合蛋白识别，

11、其翻译效率比加帽的mRNAmRNA低二十倍。低二十倍。接影响接影响mRNA的剪接效率。的剪接效率。1.2.2.2 mRNA1.2.2.2 mRNA的加尾的加尾33端多聚腺苷酸化）端多聚腺苷酸化）n几乎所有真核生物成熟的几乎所有真核生物成熟的mRNAmRNA末端都有一串约末端都有一串约250250个腺嘌呤核苷酸个腺嘌呤核苷酸尾巴。尾巴。n 它们并非模板它们并非模板DNADNA编码，而是在转录完成后由编码，而是在转录完成后由poly (A) poly (A) 多聚多聚酶合成。酶合成。n 加尾位置不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。加尾位置不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。n

12、在切除在切除mRNA 3mRNA 3末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。n真核生物真核生物mRNA poly (A)mRNA poly (A)长度并非固定不变。长度并非固定不变。n 细胞核中的细胞核中的poly (A)poly (A)长度平均为长度平均为21021020 nt20 nt，细胞质，细胞质poly poly (A )(A )长度长度19019020 nt20 nt。n 输送到细胞质中的输送到细胞质中的mRNAmRNA其其poly (A)poly (A)可由可由RNaseRNase切短，但又能切短，但又能经细胞质经细胞质polypolyA A酶重新

13、加长，保持有限的长度。酶重新加长，保持有限的长度。n 细胞质中细胞质中mRNAmRNA的的poly (A)poly (A)长度总的趋势是逐渐变短，直到长度总的趋势是逐渐变短，直到丢失大部分或全部丢失大部分或全部polypolyA A），此时），此时mRNAmRNA的寿命亦接近终点。的寿命亦接近终点。1.2.2 真核mRNA的加工加尾信号新合成的mRNA的3-端含两个明显的加尾信号。 第一个加尾信号位于poly (A)上游约1020个核苷酸处。其一致顺序为5AAUAAA3。该加尾信号中最多的变异发生在第二个碱基，其它位置的碱基代换将使Poly (A)加尾效率急剧下降。 第二个加尾信号位于5AAU

14、AAA3顺序下游约15-24 bp位置处，有一段富GU序列，紧随其后通常有一串富T的顺序： 5-AAUAAA-24 bp-GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT-3 CPSF: cleavage and polyadenylation specifity factorCstF:cleavage stimulation factor 如果改变如果改变5AAUAAA3位置，加尾位点位置，加尾位点改变。改变。 缺失缺失5AAUAAA3顺序，则不顺序，则不发生加尾。发生加尾。 富富GU序列和紧随其后的富序列和紧随其后的富T序列对正常的加尾不序列对正常的加尾不可缺一，如保留富可缺一，如保留富GU顺序

15、，除去富顺序，除去富T顺序，加尾顺序，加尾效率仅及对照的效率仅及对照的30%。 如保留富如保留富T顺序，除去顺序，除去富富GU顺序，加尾效率降至顺序，加尾效率降至10%。同时缺失。同时缺失GU序列和富序列和富T序列，即使保留序列，即使保留5AAUAAA3顺顺序也不能进行加尾。此外，序也不能进行加尾。此外，GU/T序列与序列与5AAUAAA3顺序的相对位置也很重要，顺序的相对位置也很重要，如在如在5AAUAAA3顺序的下游插入顺序的下游插入16 bp，加尾效率只有正常的加尾效率只有正常的10%。如在。如在GU序列和富序列和富T序列之间插入序列之间插入5 bp，加尾效率丧失，加尾效率丧失70%。m

16、RNA的多聚腺苷酸化的多聚腺苷酸化mRNA的多聚腺苷酸化涉及两个步骤，首先必的多聚腺苷酸化涉及两个步骤，首先必须在加尾的核苷酸位置切断须在加尾的核苷酸位置切断RNA，然后在游，然后在游离的离的3末端进行多聚腺苷酸化。末端进行多聚腺苷酸化。 有许多蛋白质参与有许多蛋白质参与poly(A)的加尾事件。的加尾事件。 1参与参与Poly(A)加尾的蛋白质称为切割加尾的蛋白质称为切割与多聚腺苷酸化专性因子与多聚腺苷酸化专性因子cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF），），CPSF专一性与加尾信号专一性与加尾信号5AAUAAA3结合。结合

17、。 2另一个蛋白即切割激发因子另一个蛋白即切割激发因子CstFcleavage stimulation factor, CstF特异附着在富特异附着在富GU区。因此区。因此CPSF和和CstF实实际结合的位置处于切割与多聚腺苷酸化位点际结合的位置处于切割与多聚腺苷酸化位点两侧。两侧。CPSF或或CstF单个因子与信号顺序结单个因子与信号顺序结合都是不稳定的，只有两者同时附着在两个合都是不稳定的，只有两者同时附着在两个信号位置才保持稳定状态。信号位置才保持稳定状态。 3此外还有另两个蛋白对此外还有另两个蛋白对RNA的切割必的切割必不可少，它们分别是切割因子不可少，它们分别是切割因子I和和IIcl

18、eavage factors I and II， CFI和和CFII），可与），可与RNA结合。结合。polyA多聚多聚酶，酶，CFI和和CFII与与RNA结合的位置处于两结合的位置处于两个加尾信号之间。虽然切割与加尾是两个性个加尾信号之间。虽然切割与加尾是两个性质不同的事件，但实际进行时几乎同时发生，质不同的事件，但实际进行时几乎同时发生，实验设计很难将其分开。实验设计很难将其分开。严格说来切割信号和加尾信号是不相同的。严格说来切割信号和加尾信号是不相同的。 前体前体mRNA切割的位置处于切割的位置处于5AAUAAA3下游下游15-25 nt之间，由切割酶专一性识别。之间，由切割酶专一性识别

19、。 polyA多聚酶只是利用已产生的多聚酶只是利用已产生的3游离末端将腺苷酸游离末端将腺苷酸逐个连接，加尾信号实际上是逐个连接，加尾信号实际上是5AAUAAA3以及下游以及下游一段不能少于一段不能少于8 nt的顺序。一旦的顺序。一旦mRNA前体被切断之后，多聚前体被切断之后，多聚腺苷酸化立即开始。腺苷酸化立即开始。 多聚腺苷酸化可细分为两个阶段，首先依赖多聚腺苷酸化可细分为两个阶段，首先依赖5AAUAAA3信号和与之结合的信号和与之结合的CPSF缓慢合成约缓慢合成约10个个核苷酸，然后依赖已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上核苷酸，然后依赖已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上200或更多个腺苷酸。

20、或更多个腺苷酸。Cleavage of the 3 end of histone mRNA may require a small RNA Histone mRNAs are not polyadenylated; their 3 ends are generated by a cleavage reaction that depends on the structure of the mRNA. The cleavage reaction requires the SLBP to bind to a stem-loop structure, and the U7 snRNA to pair

21、with an adjacent single-stranded region. 增加增加mRNAmRNA的稳定性的稳定性 将携带或缺少将携带或缺少polypolyA A的球蛋白的球蛋白mRNAmRNA注入到蛙卵中，注入到蛙卵中，结果发现，在结果发现，在6 6小时后缺少小时后缺少polypolyA A的球蛋白的球蛋白mRNAmRNA不再进不再进行翻译，而携带行翻译，而携带polypolyA A的处理仍然正常合成球蛋白。最的处理仍然正常合成球蛋白。最简单的解释是，简单的解释是，polypolyA A有助于增加有助于增加mRNAmRNA的稳定性的稳定性 提高提高mRNAmRNA翻译效率翻译效率 m

22、RNA mRNA的翻译需要的翻译需要PAB IPAB IpolypolyA A） binding protein binding protein I I，polypolyA A结合蛋白结合蛋白I I的蛋白参与，它们与的蛋白参与，它们与polypolyA A的结合可提高的结合可提高mRNAmRNA的翻译效率。如果在的翻译效率。如果在mRNAmRNA样品中加入过样品中加入过量的量的polypolyA A），可急剧降低蛋白质合成的数量。原因在于），可急剧降低蛋白质合成的数量。原因在于大量大量polypolyA A与与PAB IPAB I因子竟争性结合，使因子竟争性结合，使mRNAmRNA缺少必需缺少

23、必需的的PAB IPAB I，因而不能有效翻译。此外适当延长，因而不能有效翻译。此外适当延长polypolyA A核核苷酸数目可控制苷酸数目可控制mRNAmRNA的翻译。活细胞中很少的翻译。活细胞中很少mRNAmRNA的的polypolyA A长度少于长度少于30 nt30 nt，低于这一长度，低于这一长度mRNAmRNA不能翻译。不能翻译。 polypolyA A可影响可影响mRNAmRNA前体最后一个内含子的剪切，缺少前体最后一个内含子的剪切，缺少polypolyA A使剪接效率降低使剪接效率降低5-105-10倍。倍。o1 1、核酶、核酶o2 2、RNARNA中的内含子中的内含子o3 3

24、、RNARNA的剪切的剪切o4 4、RNARNA的编辑和修饰的编辑和修饰 RNA RNA的剪接的剪接 转录后加工是产生各种成熟RNA分子的重要过程 在真核生物的mRNA前体中，将内含子intron去除，而把外显子exon连接起来形成成熟RNA分子的过程，称为RNA剪接RNA splicing）。加工过程加工过程推测的生理功能推测的生理功能加帽反应加帽反应mRNAmRNA从核内向胞质运输从核内向胞质运输加尾反应加尾反应转录终止，翻译起始和转录终止，翻译起始和mRNAmRNA降解降解RNARNA剪接剪接从从mRNAmRNA、tRNAtRNA和和rRNArRNA分子中切除内含子分子中切除内含子RNA

25、RNA切割切割从前体从前体RNARNA中释放成熟中释放成熟tRNAtRNA和和rRNArRNARNARNA加工过程及其生理功能加工过程及其生理功能1. 1. 核酶核酶(ribozyme)(ribozyme)o核酶核酶(ribozyme)(ribozyme)有的译为核糖拟酶，核酶等。有的译为核糖拟酶，核酶等。o核酶是核酶是T TCechCech和和S SAltman (1981Altman (1981年年) )在研究四膜在研究四膜虫虫rRNArRNA时发现的，时发现的，19821982年年T TCechCech由核糖核酸由核糖核酸(ribonucleic acid)(ribonucleic ac

26、id)和酶和酶(enzyme)(enzyme)这两个词这两个词“重重组成一个新的词：组成一个新的词：“ribozyme”“ribozyme”。o它是指本质为它是指本质为RNARNA或以或以RNARNA为主含有蛋白质辅基的、为主含有蛋白质辅基的、具有催化功能的一类物质。具有催化功能的一类物质。一、核酶一、核酶核酶和酶的区别，主要在：核酶和酶的区别，主要在：一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的或带有蛋白的RNA；核酶既是催化剂又是底物，随着反应的核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反

27、应前后其本身的质和仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。量都不发生改变。核酶催化的反应分为两类：核酶催化的反应分为两类：自体催化包括：自体催化包括： 第一组内含子的第一组内含子的自我剪接；自我剪接； 第二组内含子的第二组内含子的自我剪切；自我剪切； 植物类病毒和拟植物类病毒和拟病毒的自我剪切。病毒的自我剪切。半自体催化包括：半自体催化包括： 核核mRNA内含内含子的剪切；子的剪切； 锥虫锥虫SLRNA的反式拼接；的反式拼接； tRNA 5加加工工 （不属于转酯反应（不属于转酯反应内含子的剪接，但也是核酶的活性内含子的剪接，但也是核酶的活性之一）之一） 除核酶之外，核酸酶和由内含除核酶

28、之外，核酸酶和由内含子本身编码的成熟酶也参与某些内子本身编码的成熟酶也参与某些内含子的剪切，如真核含子的剪切，如真核tRNA内含子内含子和酵母和酵母cob基因的内含子的基因的内含子的2的剪的剪接。接。2. RNA2. RNA中的内含子中的内含子基因基因长度长度/kb/kb内含子数量内含子数量内含子所占比例内含子所占比例 /%/%胰岛素 1.42 67球蛋白 1.42 69血清蛋白 1813 89胶原蛋白组分 31117 71因子 18625 95萎缩性肌强直因子 2 40078 99部分人类基因中，内含子序列所占比重的分析内含子去除、内含子去除、RNARNA的剪接基本方式：的剪接基本方式：在高

29、等真核生物，核在高等真核生物，核RNARNA内含子的去除内含子的去除由剪接装置由剪接装置(splicing apparatus)(splicing apparatus)完成，在外显子和内含子交界处和完成，在外显子和内含子交界处和内含子内部有可供识别的特异序列，内含子内部有可供识别的特异序列，剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成；成；有两类内含子的去除属自剪接，具有有两类内含子的去除属自剪接，具有中部核心结构，形成特定的二级结中部核心结构，形成特定的二级结构，构，RNARNA具有催化剪接的作用；具有催化剪接的作用；酵母酵母tRNAtRNA的剪接需要蛋白质酶的参与，的剪接

30、需要蛋白质酶的参与，该酶与该酶与tRNAtRNA后加工过程中的酶有相后加工过程中的酶有相似之处。除似之处。除tRNAtRNA的剪接之外，其他的剪接之外，其他RNARNA的剪接尽管参与反应的要素不同，的剪接尽管参与反应的要素不同，但都属于转酯反应。但都属于转酯反应。n内含子的边界顺序由保守的基序组成内含子的边界顺序由保守的基序组成比较大量的真核生物比较大量的真核生物mRNAmRNA内含子发现，它们的两侧边界均有一对保守顺序，即内含子发现，它们的两侧边界均有一对保守顺序，即5-5-端为端为GUGU，3-3-端为端为AGAG，这类称为，这类称为GUGUAGAG的内含子均以相同方式剪切。的内含子均以相

31、同方式剪切。 在不同的真核生物中，内含子的一致顺序有不少变化，动物中典型的剪接在不同的真核生物中，内含子的一致顺序有不少变化，动物中典型的剪接位置一致顺序组成为：位置一致顺序组成为： 5AGGUAAGU-YNYURAY-Y10-20-YAG3 其中其中Y为为U或或C，N为任何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。为任何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。5端剪接位称供体位端剪接位称供体位donor site），），3端剪接位称受体位端剪接位称受体位acceptor site）。）。 仅仅仅仅GUAG边界顺序并不能保证内含子的正确剪切，因为在内含子中边界顺序并不能保证内含子的正确剪切，因为

32、在内含子中有不少相同的有不少相同的GUAG顺序。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少顺序。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于的序列称为分枝点，位于3-端剪接位的上游，具有特征性组成：端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶表示嘧啶U或或C），），R表示嘌呤表示嘌呤A或或G），），A是剪接时是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。参与剪接事件蛋白接合的位置。 酵母中分枝点序列为酵母中分枝点序列为5UACUAAC3，位于，位于

33、3剪接位上游剪接位上游18到到140 bp之间，其作用不同于高等真核生物。之间，其作用不同于高等真核生物。类型类型分布分布GU-AG内含子内含子真核生物细胞核前体真核生物细胞核前体mRNAAU-AC内含子内含子真核生物细胞核前体真核生物细胞核前体mRNAI型（型（Group ）内含子）内含子真核生物细胞核前体真核生物细胞核前体rRNA细胞器细胞器RNA,少数细菌少数细菌RNAII型（型（Group ）内含子）内含子细胞器细胞器RNA，某些原核，某些原核RNAIII型（型（Group ）内含子）内含子细胞器细胞器RNA双内含子（双内含子（Twintron）细胞器细胞器RNA前体前体tRNA内含子

34、内含子真核生物细胞核前体真核生物细胞核前体tRNA古细菌内含子古细菌内含子不同的不同的RNA3 3、RNARNA的剪切的剪切o3.1 mRNA前体的剪切o 3.1.1 核内小RNAo 3.1.2 RNA的剪切过程o3.2 类内含子剪切o3.3 类内含子剪切o3.4 顺式剪切与反式剪切 3.1.1 核内小RNA 3.1.2 RNA的剪切过程3.1 mRNA前体的剪切前体的剪切3.1.1 剪接要求剪接要求snRNAs的参与的参与U1 snRNA 碱基互补配对方碱基互补配对方式式识别识别mRNA前体前体5剪切点剪切点U2辅助因子辅助因子 与与3剪切点上游的剪切点上游的富嘧啶区结合富嘧啶区结合识别识别

35、mRNA前体前体3剪切点剪切点U2 snRNP 与分支点结合与分支点结合U2 snRNA 剪切前体剪切前体 60S剪切体剪切体spliceosome U4、U5、U6 snRNP三聚体三聚体 3.1.2 核核mRNA的剪接的剪接n核核mRNA的剪接过程和的剪接过程和类内含子十分相似，类内含子十分相似，根本区别是：核根本区别是：核mRNA前体本身不能形成二级前体本身不能形成二级结构，必需依赖于结构，必需依赖于snRNP(U1,U2,U4,U5和和U6)的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。n结构特点：结构特点：n 边界顺序边界顺序 完全符合完全符合GU-AG法则

36、法则n 含分枝点序列含分枝点序列n 内含子内含子5端保守序列端保守序列5GUAAGUA3）n 和和U1snRNA的的5端保守序列端保守序列 3CAUUCAU5互补互补 u1u2u5u4u6u1u4u5u4u6u2u5u5u2u6u1u1u2u2u2u6 E complex + U2 A complex (U2与分枝位结合与分枝位结合)B1 complex (U5/U4/U6三聚体三聚体结合，结合，U5结合在外显子结合在外显子5端，端，U6与与U2结合结合)B2 complex (释放出释放出U1,U5从从外显子向内含子移动，外显子向内含子移动，U6结合结合在在5剪接位点剪接位点)C1 comp

37、lex (释放出释放出U4,U6/U4催化转酯反应，催化转酯反应，U5结合在外显结合在外显子子3剪接位点剪接位点.5位点被切开，位点被切开，形成套索形成套索)C2 complex (U2/U5/U6仍结合仍结合在套索上。在套索上。3位点被切开，外显位点被切开，外显子被连接子被连接)释放出剪接了的释放出剪接了的RNA,套索脱分套索脱分枝成线状。枝成线状。播放动画mRNA splicing. mov 3.2 类内含子及其剪接类内含子及其剪接n1.发现n Cech et al. 1981 n 研究四膜虫Tetrahymena thermophila）n 35S的前体 rRNA含有413nt 的内含子

38、）n n 在体外能够进行自我剪接 2.2.分布分布 类内含子常分布于低等真核生物的类内含子常分布于低等真核生物的细胞器中，细胞器中， 如四膜虫的如四膜虫的rRNArRNA； 大部分真菌如酵母的大部分真菌如酵母的mtDNAmtDNA； 植物叶绿体基因的内含子；植物叶绿体基因的内含子； T4 T4噬菌体的噬菌体的3 3个基因中也存在个基因中也存在类内类内含子含子 3.3.结构特点结构特点 边界序列为边界序列为5UG35UG3 内含子中有中部核心结构内含子中有中部核心结构(central (central core stucture)core stucture) 内部引导序列内部引导序列intern

39、al guide internal guide sequenece,IGSsequenece,IGS）IGS内部引导序列（内部引导序列（ internal guide sequenece,IGS ）：）：1982年由年由Davies提出，由提出，由6个个nt组成，组成，GGAGGG四膜虫）。内含子中可与外显子配对的序列称为四膜虫）。内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导区。内部引导区。最初认为最初认为IGS的作用是通过和两个外显子近侧区配对，的作用是通过和两个外显子近侧区配对，使外显子并在一起，现在认为其作用是决定剪接的使外显子并在一起，现在认为其作用是决定剪接的专一性。专一性。 酸酯键的直

40、酸酯键的直接转移，没接转移，没有水解，不有水解，不需能量。需能量。即即G苷苷酸结合位点和酸结合位点和底物结底物结合位点，后者合位点，后者依赖于依赖于IGS的配对来的配对来确定。确定。G的参与完成的参与完成剪接反剪接反应。即剪接反应。即剪接反应完全应完全由内含子自身由内含子自身完成。完成。3.3 类内含子的剪接类内含子的剪接n类内含子的剪接和类内含子的剪接和类内含子不同，而和核类内含子不同，而和核mRNA内含子的剪切有些相似。内含子的剪切有些相似。n分布：在酵母分布：在酵母mtRNA,细胞色素氧化酶的细胞色素氧化酶的a亚基、亚基、b亚亚基，玉米基，玉米mtRNA、tRNA以及真核以及真核mRNA

41、前体中。前体中。n边界序列为边界序列为5GUGCG- - -YnAG,符合符合GTAG法法则则v与前所叙的核基因与前所叙的核基因mRNA的剪接过程相比，的剪接过程相比，类内含子的最大特定是不需要其他成分的类内含子的最大特定是不需要其他成分的参与，参与，RNA分子本身能形成剪接所需的空间分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在核基因结构和催化活性区域。在核基因mRNA的剪的剪接过程中，需要多种成分特别是接过程中，需要多种成分特别是snRNA与与RNA前体共同作用才能形成剪接所需的空间前体共同作用才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。结构，产生具催化功能的区域。3.4 顺式剪

42、切与反式剪接顺式剪切与反式剪接 3.4.1 顺式剪接顺式剪接cis-splicing） 内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式剪接。子彼此连接，称为顺式剪接。 对很多基因而言，对很多基因而言，RNA剪接是一个不变的加工过程。基因转录时所有剪接是一个不变的加工过程。基因转录时所有细胞中产生同样的成熟转录本及单种产物。这称为组成型剪接细胞中产生同样的成熟转录本及单种产物。这称为组成型剪接(constructive splicing)。 其他一些基因，其他一些基因，RNA剪接可以作为基因调节的机

43、制，也就是说在两种剪接可以作为基因调节的机制，也就是说在两种组织中同一基因表达不同，尽管它以相同的方式和速度转录。这样的调节以组织中同一基因表达不同，尽管它以相同的方式和速度转录。这样的调节以两种方式发生。两种方式发生。 第一种情况第一种情况: 加工或去除调节加工或去除调节(processing ordiscard regulation)，初始转录本在一些组织中加工，在其他组，初始转录本在一些组织中加工，在其他组织中不剪接。织中不剪接。 在有些低等真核生物中在有些低等真核生物中(如海胆如海胆)，这是主要调节机制。，这是主要调节机制。大部分基因在大部分组织中转录，由大部分基因在大部分组织中转录，

44、由RNA加工调节来决加工调节来决定那些基因被翻译。在果蝇中，一个类似的机制用来控定那些基因被翻译。在果蝇中，一个类似的机制用来控制制P因子转座酶因子转座酶(参阅参阅)的合成，在这种情况下虽然只有一的合成，在这种情况下虽然只有一个内含子未被剪接，但却限制了个内含子未被剪接，但却限制了P因子转座只发生在生殖因子转座只发生在生殖细胞中。细胞中。 转座酶基因包含三个内含子，在生殖细胞中产生成熟转座酶基因包含三个内含子，在生殖细胞中产生成熟的编码转座酶的转录本，然而在其他组织中，第三个含的编码转座酶的转录本，然而在其他组织中，第三个含终止密码子的内含子被保留，使转座酶蛋白截短，从而终止密码子的内含子被保

45、留，使转座酶蛋白截短，从而阻止体细胞中阻止体细胞中P因子的转座。因子的转座。 内源性基因也用同样的策略，如哺乳动物内源性基因也用同样的策略，如哺乳动物GABAA受受体体E亚基的亚基的mRNA前体除了脑以外其他组织都不剪接。前体除了脑以外其他组织都不剪接。 第二种情况第二种情况: : 差别或选择性剪接差别或选择性剪接 (differential alternative splicing) (differential alternative splicing)基本转录体通过选择使用外显子以不同方式加工基本转录体通过选择使用外显子以不同方式加工 相关成熟转录体家族产生不同基因产物，相关成熟转录体家族

46、产生不同基因产物， 称为剪接变异体称为剪接变异体(splicevariants)(splicevariants)或剪接异构体或剪接异构体(spliceisoforms)(spliceisoforms)。可变剪接产生多种可变剪接产生多种RNA选择性剪接以多种方式进行：选择性剪接以多种方式进行： 1利用不同的外显子利用不同的外显子 由于不同细胞类型有着不同修饰的由于不同细胞类型有着不同修饰的反式因子，导致利用不同的外显子。反式因子，导致利用不同的外显子。例如动物细胞的原肌球蛋白例如动物细胞的原肌球蛋白(atropomyosin) 基因有基因有13个外显子。个外显子。2) 两个相互排斥的外显子的剪接

47、两个相互排斥的外显子的剪接 有两类外显子对，每对之中只有一个成员能剪接到有两类外显子对，每对之中只有一个成员能剪接到成熟的成熟的mRNA中，看来像是相互排斥似的。降钙素中，看来像是相互排斥似的。降钙素(calcitonin)和降钙素基因相关肽和降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP)分别利用分别利用相邻的两个外显子，得到的两种产物分别为甲状腺相邻的两个外显子，得到的两种产物分别为甲状腺和神经元细胞中所特有。和神经元细胞中所特有。 (3)半个起始位点，多个加半个起始位点，多个加poly(A)位点位点 一些真核病毒转录物存在多至一些真核病毒转录物存在多

48、至5个这样的位点个这样的位点(Tsurshital988)。对于一个有两个加。对于一个有两个加poly(A)位点的转位点的转录物，大多数细胞类型通过利用内侧的位点产生分泌型录物，大多数细胞类型通过利用内侧的位点产生分泌型的蛋白，一些分化的细胞类型犀其产物是膜蛋白的转录的蛋白，一些分化的细胞类型犀其产物是膜蛋白的转录物，则利用外侧的位点产生具有膜锚序列的膜结合蛋白。物，则利用外侧的位点产生具有膜锚序列的膜结合蛋白。还是用降钙素和还是用降钙素和CGRP的例子，前者利用内侧的加的例子，前者利用内侧的加poly(A)位点，后者则利用外侧的。可能存在某种细胞位点，后者则利用外侧的。可能存在某种细胞类型特

49、异的反式激活因子提高外侧位点的利用效率。类型特异的反式激活因子提高外侧位点的利用效率。(4)(4)多个多个55剪接位点竞争同一剪接位点竞争同一33剪接位点剪接位点 有一些基因含有多个有一些基因含有多个55剪接位点，它们的选择依赖于剪接位点，它们的选择依赖于55剪接位点的强度剪接位点的强度( (高度适配者强高度适配者强) )、与、与33剪接位点的接近剪接位点的接近程度、空间限制等因素之间的平衡。程度、空间限制等因素之间的平衡。在大多数细胞类型中将选择上游的在大多数细胞类型中将选择上游的55剪接位点，而使处剪接位点，而使处于下游的于下游的55剪接位点无效，主要是因为后者与分叉点的剪接位点无效，主要

50、是因为后者与分叉点的距离一般太近而不利于建立剪接体之故距离一般太近而不利于建立剪接体之故(Noble l988)(Noble l988)。也有的分别利用不同的也有的分别利用不同的55剪接位点，得到不同的产物。剪接位点，得到不同的产物。 (5)(5)内含子保留和框式外显子内含子保留和框式外显子 有的情况下，一个内含子不被剪接而有的情况下，一个内含子不被剪接而保留下来，如果维持可读框架，便是一保留下来，如果维持可读框架，便是一个多肽片段的插入；如果移格，便会产个多肽片段的插入；如果移格，便会产生功能不同的产物或者关掉基因的表达。生功能不同的产物或者关掉基因的表达。 所谓盒式外显子是指那些与其他邻所

51、谓盒式外显子是指那些与其他邻近的外显子的剪接无关而独立剪接的外近的外显子的剪接无关而独立剪接的外显子。当几个盒式外显子存在于同一个显子。当几个盒式外显子存在于同一个转录物中，其产物会产生高度的趋异，转录物中，其产物会产生高度的趋异，如一个基因含有如一个基因含有5 5个盒式外显子，再加个盒式外显子，再加上一对相互排斥的外显子，在理论上可上一对相互排斥的外显子，在理论上可以生以生6464种同工型多肽。种同工型多肽。 真核基因存在真核基因存在5 5个以上的外显子是常个以上的外显子是常有的，甚至多达有的，甚至多达3737个外显子，个外显子， 由此产由此产生蛋白质的多样性是十分丰富的。生蛋白质的多样性是

52、十分丰富的。 肌钙蛋白肌钙蛋白T有有13个外显子，编码个外显子，编码259个氨基酸残基，然而此个氨基酸残基，然而此蛋白的长度在体内不同部位的肌肉中是不同的。蛋白的长度在体内不同部位的肌肉中是不同的。有有11个外显子个外显子(黑框黑框)是所有是所有mRNA都有的；都有的；外显子外显子48(白框白框)则可自由组合则可自由组合(4、6、8，4、7、8，7、8等等等等)，共有，共有32种可能性；种可能性；外显子外显子16和和17(灰框灰框)是相互排斥的，两者只能有一个出现在是相互排斥的，两者只能有一个出现在成熟的蛋白质中。成熟的蛋白质中。这样，总共就有这样，总共就有64种可能的种可能的mRNA。(6)

53、(6)非剪接位点的序列参与调节非剪接位点的序列参与调节 一些真核生物的病毒一些真核生物的病毒RNARNA其初级转录物即使其初级转录物即使有正确的功能剪接位点，有时也会有一部有正确的功能剪接位点，有时也会有一部分甚至大部分不发生剪接分甚至大部分不发生剪接(ArrigoandBeemon1988)(ArrigoandBeemon1988)。这是由于其内含。这是由于其内含子中存在一种负调节元件使剪接无效，也子中存在一种负调节元件使剪接无效，也有的基因在外显子中存在一些促进和抑制有的基因在外显子中存在一些促进和抑制剪接的序列。剪接的序列。返回返回返回 U群snRNA+多肽snRNPU群snRNA是一群

54、丰富的小分子RNA,其序列进化上相对保守，但通过转录后碱基修饰会导致其二级结构的改变，因而构成不同功能的snRNP,使之识别和竞争不同的剪接位点。剪接体剪接体/ /拼接体的装配：拼接体的装配：1 1、 U1 snRNP U1 snRNP与与55剪接剪接位点结合位点结合2 2、 U2 snRNP U2 snRNP与分枝点结与分枝点结合合3 3、 U4/U6 U4/U6和和U5snRNPU5snRNP结合结合上上4 4、 最后形成剪接体，最后形成剪接体，U5U5既与既与55剪接位点也与剪接位点也与33剪接位点结合。剪接位点结合。 参加剪接反应的蛋白质因子有两种类型： 一类结合在UsnRNA上形成s

55、nRNP复合物，例如Sm蛋白，共同地与U1、U2、U5 snRNA紧密结合；U1 snRNP中有3种而U5snRNP有7种蛋白紧密地与之特异结合。 另外，还有一些蛋白暂时地与snRNP组分相互作用并起着特殊的作用，它们是一些RNA依赖的ATPase和螺旋酶，如酵母的PRP24促进U4U6复合物的形成，PRP4通过蛋白蛋白相互作用结合U4U6snRNP和U5snRNP形成上述的三元snRNP复合物；PRP8与U5snRNP结合并和3剪接位点相互作用。这些蛋白的一部分基序结合到RNA上，另一部分结合到蛋白质上形成蛋白“桥”，介导RNA-RNA相互作用，以及剪接体构象改变，通过决定构象改变的计时来影

56、响剪接。 另一类是一些结构相关进化上保守的蛋白质因子，称之为另一类是一些结构相关进化上保守的蛋白质因子，称之为SR(SRP)家族。家族。已发现此家族的成员有已发现此家族的成员有SRP20、SRP30a、 (SF2ASF)、SRP30b(PR264SC35)、SRP40、SRP55、SRP7075(数字表示分子质量，数字表示分子质量，kDa)，这些蛋白的，这些蛋白的N端端有一个共同的基序有一个共同的基序(RRM或或RBD)识别和结合识别和结合RNA；其；其C端端长度变化，长度变化， 由交替的丝氨酸和精氨酸残基组成的结构域由交替的丝氨酸和精氨酸残基组成的结构域可能和结合特异性有关。可能和结合特异性

57、有关。这些蛋白在剪接过程早期起着帮助前这些蛋白在剪接过程早期起着帮助前mRNA投入剪接，后投入剪接，后期护送期护送snRNP加入剪接体，在剪接的两步反应中一直与剪加入剪接体，在剪接的两步反应中一直与剪接体缔合。由于这些蛋白因子的表达量是组织特异的，而接体缔合。由于这些蛋白因子的表达量是组织特异的，而它们存在的量和剪接位点的选择又相关，因而不同的它们存在的量和剪接位点的选择又相关，因而不同的SRP蛋白对不同的剪接位点的优先利用表现为一种组织特异性。蛋白对不同的剪接位点的优先利用表现为一种组织特异性。SRP蛋白在离体剪接中都表现出活性的互补，但不同的蛋白在离体剪接中都表现出活性的互补，但不同的SR

58、P蛋白有其保守性，蛋白有其保守性， 又说明每种又说明每种SRP蛋白应有其不同蛋白应有其不同的功能。的功能。 3.4.2 反式剪接反式剪接(transsplicing) 前面讨论的剪接过程都是发生在一个前面讨论的剪接过程都是发生在一个RNA分子内部，即通过剪接将一个分子内部，即通过剪接将一个RNA分子内的内含子剪掉，使外显子连接在一起分子内的内含子剪掉，使外显子连接在一起顺式剪接顺式剪接(cis-splicing) 。 但也有另外一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反但也有另外一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反式剪接式剪接trans-splicing） 已发现，在

59、锥虫、线虫以及植物的叶绿体中发生两个已发现，在锥虫、线虫以及植物的叶绿体中发生两个RNA分子之间的剪分子之间的剪接，即反式剪接。接，即反式剪接。 反式剪接是以两种不同来源的反式剪接是以两种不同来源的RNA前体分子前体分子作为底物。反式剪接的作为底物。反式剪接的5端外显子称为剪接前端外显子称为剪接前导导RNA(spliced leader RNA，SL RNA)。经过。经过剪接在成熟的剪接在成熟的mRNA非翻译部分非翻译部分5端剪接上一端剪接上一小段称为小段称为“剪接前导序列剪接前导序列(spliced leader，SL)”或或“小外显子小外显子(mini-exon)”的的RNA片段。片段。

60、这些片段本来并不存在于相应的编码基因前这些片段本来并不存在于相应的编码基因前面，而是由其他面，而是由其他DNA链转录而来。已发现的各种链转录而来。已发现的各种SL RNA有一些共同的特点：都折叠成一种相同有一些共同的特点：都折叠成一种相同的二级结构，此结构有的二级结构，此结构有3个茎个茎环环(stem-loop)和和一个单链区，此单链区类似于一个单链区，此单链区类似于U1的的Sm结合位点。结合位点。因而，因而，SL RNAs存在和存在和snRNPs相似的形式。相似的形式。4 RNA的编辑和修饰的编辑和修饰4.1 RNA编辑RNA editing） 某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导