第七章酶联免疫分析法ppt课件

1、第七章第七章 酶联免疫分析法酶联免疫分析法第七章第七章 酶联免疫分析法酶联免疫分析法 基本要求：基本要求： 了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析法中使用的酶，熟悉法中使用的酶，熟悉ELISAELISA的原理，掌握的原理，掌握ELISAELISA的固相的固相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液及及ELISAELISA法常用酶的底物系统，掌握法常用酶的底物系统，掌握ELISAELISA的酶联方法的

2、酶联方法和试验方法，熟悉和试验方法，熟悉ELISAELISA反应条件的选择，掌握反应条件的选择，掌握ELISAELISA的定量计算，了解的定量计算，了解ELISAELISA的灵敏度提高途径，熟悉的灵敏度提高途径，熟悉ELISAELISA放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常用的生物发光反应体系。用的生物发光反应体系。第七章第七章 酶联免疫分析法酶联免疫分析法第一节第一节

3、酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二节 光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述一、免疫分析一、免疫分析1 1、免疫分析发展史、免疫分析发展史免疫分析免疫分析ImmunoassayImmunoassay，IAIA是利用待测物质抗原是利用待测物质抗原或抗体与其相对应物质抗体或抗原之间专一特或抗体与其相对应物质抗体或抗原之间专一特异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。异性反应而建立起来的一种高选择性分析方法。免疫分析主要基于用抗体或抗原作为选择性化学试免疫分析主要基于用抗体或抗原作为选择性化学试剂以分析测

4、定抗原或抗体及半抗原。剂以分析测定抗原或抗体及半抗原。宋代宋代 人工痘苗预防烈性传染病天花人工痘苗预防烈性传染病天花19711971年年 第一届国际免疫学会议第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物学将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。分开发展成一门独立的学科。 “免疫免疫immunityimmunity）”一词源于一词源于 “immunitas” “immunitas”，原，原意是免除税赋和差役。意是免除税赋和差役。 研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力研究。 2020世纪中期以后，人们逐渐开始对各种抗原、微生物世纪中期以后，人们逐渐开始对各种

5、抗原、微生物的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、的作用进行研究，发展出基础免疫学、临床免疫学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。免疫学检测、医学免疫学等多个分支。 现代免疫学将现代免疫学将“免疫免疫定义为：机体对定义为：机体对“自己自己和和“异己异己识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。，正常情况下是维持内环境稳定的一种生理性功能。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、抗原、抗体与免疫反应、抗原、抗体与免疫反应抗原是能够引起免疫反应的分子。抗原是能够引起免疫反应的分子。免疫原性免疫

6、原性immunogenicityimmunogenicity指诱导刺激免疫系统产生指诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力。抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为免疫原具有免疫原性的物质称为免疫原immunogenimmunogen）。）。免疫反应原性免疫反应原性immunoreactivityimmunoreactivity或抗原性或抗原性antigenicityantigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。生特异性结合，引起免疫反应的性能。具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应具备上述

7、两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反应性的物质被称为半抗原性的物质被称为半抗原haptenhapten）。）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述 抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。白都是抗体。 例如无免疫活性的免疫球蛋白如骨髓瘤蛋白就不例如无免疫活性的免疫球蛋白如骨髓瘤蛋白就不是抗体，尽管其结构与抗体相似。是抗体，尽管其结构与抗体相似。 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液

8、中也有存在。也有存在。 抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，使得抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具有高特异性即专一性和可逆性。有高特异性即专一性和可逆性。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述 抗原、抗体发生如下免疫反应：抗原、抗体发生如下免疫反应： Ag+Ab Ag-AbAg+Ab Ag-Ab 该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为基本原理，其反应式为 式中：式中：AbAb为游离的抗体结合位点的浓度；为

9、游离的抗体结合位点的浓度；AgAg为游为游离的抗原结合位点的浓度；离的抗原结合位点的浓度；Ab-AgAb-Ag为抗原为抗原- -抗体复合抗体复合物的浓度；物的浓度；k1k1为正反应速率常数；为正反应速率常数；k2k2为负反应速率常为负反应速率常数；数；K K为反应平衡常数亲和常数）。为反应平衡常数亲和常数）。Kkk21AbAgAg-Ab第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述 这种抗原这种抗原- -抗体反应既可发生于体内抗体反应既可发生于体内in vivoin vivo），也），也可发生于体外可发生于体外in vitroin vitro）。）。 抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中

10、多采抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采用血清做试验，所以体外抗原用血清做试验，所以体外抗原- -抗体反应也称为血清抗体反应也称为血清学反应学反应serologic reactionserologic reaction）。）。 基于抗原基于抗原- -抗体反应的检测技术主要应用于以下几个抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：用已知抗原检测未知抗体；方面：用已知抗原检测未知抗体； 用已知抗体检测未知抗原；用已知抗体检测未知抗原； 定性或定量检测体内各种大分子物质；定性或定量检测体内各种大分子物质； 用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物

11、质。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述二、酶标记免疫分析法及常用标记酶二、酶标记免疫分析法及常用标记酶1 1、免疫分析法分类、免疫分析法分类第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、酶标记免疫分析法中使用的酶、酶标记免疫分析法中使用的酶（1 1酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件：酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件：纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强；具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；偶联后仍保持较高的催化活性；使用稳定性和保存稳定性好；使

12、用稳定性和保存稳定性好；测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；测定酶活性的方法简便、灵敏、快速；待测体液中不存在与标记酶相同的酶；待测体液中不存在与标记酶相同的酶；第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质；反应的干扰物质；酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉；酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉；均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原原- -酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。酶结合物结合后，酶活性表现出抑制或激活。第一节第

13、一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述（2 2酶的评价指标酶的评价指标 通常用通常用RZRZ和酶的比活力评价标记和酶的比活力评价标记酶的质量。酶的质量。RZRZ表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比表示酶蛋白中活性部分与非活性部分最大吸光度的比值。值。酶的比活力指在特定条件下，每酶的比活力指在特定条件下，每1mg1mg酶或每酶或每1ml1ml酶液所具酶液所具有的酶活性单位数。有的酶活性单位数。（3 3酶联免疫分析中的常用酶酶联免疫分析中的常用酶 下表列出了酶联免疫下表列出了酶联免疫分析中的常用酶。其中分析中的常用酶。其中ECEC编号是根据国际酶学委员会编号是根据国际酶学委员会的规定采用

14、四码编号法确定的每个酶的系统编号。的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述酶酶来源来源EC编号编号辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶动植物动植物3.1.3.2碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛肠牛肠3.1.3.1-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶大肠杆菌大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6过氧化氢酶过氧化氢酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛红细胞牛红细胞4.2.1.1乙酰

15、胆碱酶乙酰胆碱酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶鸡卵白鸡卵白3.2.1.17苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶猪心线粒体猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶无机焦磷酸酶大肠杆菌大肠杆菌3.6.1.1荧光素酶荧光素酶发光生物发光生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳动物组织哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶酶联免疫分析常用酶第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶horseradish peroxidasehorseradish peroxidase，HRPHRP是一种提取自辣

16、根中，相对分子质量为是一种提取自辣根中，相对分子质量为44kDa44kDa的糖蛋的糖蛋白。白。其酶学活性部分包括脱辅基蛋白和血红素基团，辅基亚其酶学活性部分包括脱辅基蛋白和血红素基团，辅基亚铁血红素在铁血红素在403nm403nm波长呈现最大光吸收值。波长呈现最大光吸收值。HRPHRP的纯度以的纯度以RZRZ值即值即A403nm/A275nmA403nm/A275nm的值来衡量，高纯度的值来衡量，高纯度HRPHRP制剂的制剂的RZ3.0RZ3.0。通常以能在通常以能在2020、pHpH为为6.06.0、20s20s的时间内催化底物邻苯的时间内催化底物邻苯三酚产生三酚产生1mg1mg红桔酚红桔酚

17、purpurogallinpurpurogallin作为作为HRPHRP酶的酶的1 1个活性单位。个活性单位。用于标记的用于标记的HRPHRP比活性应大于比活性应大于250U/mg250U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述碱性磷酸酶碱性磷酸酶alkaline phosphatasealkaline phosphatase，APAP几乎存在几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。细胞、肾小管中含量高。APAP是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、磷酸是一种磷酸酯的水解酶，它能够催化磷酸单酯、

18、磷酸核苷及核苷及6-6-磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时产磷酸糖类等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。生有色的或荧光的产物。碱性磷酸酶的分子质量为碱性磷酸酶的分子质量为8080100kDa100kDa，最适，最适pHpH为为8.08.010.010.0，随酶源和底物的不同而变化。，随酶源和底物的不同而变化。APAP活性的测定以对硝基磷酸苯酯活性的测定以对硝基磷酸苯酯PNPPNP作为底物。作为底物。用作标记的用作标记的APAP比活力应大于比活力应大于1000U/mg1000U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶glucose oxid

19、aseglucose oxidase，GODGOD即即-D-D-葡葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。它催化它催化O2O2和和-D-D-葡萄糖的反应形成葡萄糖的反应形成H2O2H2O2和和D-D-葡萄糖酸葡萄糖酸- -内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。其反应最适其反应最适pHpH范围为范围为4.04.07.07.0，pH5.5pH5.5时，反应速率最时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对大。葡萄糖氧化酶对-D-D-葡萄糖的葡萄糖的-异头碳有高度异头碳有高度专一性。专一性。葡萄糖氧化酶的比活力至少为葡萄糖氧化酶的比活力至少为20U

20、/mg20U/mg。葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在44下可稳定存在下可稳定存在6 61212个月。个月。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-D-galactosidase-D-galactosidase，GalGal即乳即乳糖酶糖酶-lactase-lactase），广泛存在于植物、动物器官、），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。细菌、酵母和真菌中。当当GalGal催化水解催化水解-D-D-半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为水解；若受体是糖或醇时，转移到水分子受体，称为水解；若受体是糖或醇时，称

21、为转半乳糖苷。称为转半乳糖苷。GalGal催化催化-D-D-半乳糖苷水解反应的最适半乳糖苷水解反应的最适pHpH为为7.57.5，转化，转化效率很高，且比效率很高，且比HRPHRP易于标记，背景值低，稳定性好易于标记，背景值低，稳定性好。GalGal比活力应不少于比活力应不少于30U/mg30U/mg，55能保存能保存1 12 2年。年。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法一、光度酶联免疫分析一、光度酶联免疫分析1 1、酶联免疫吸附分析、酶联免疫吸附分析enzyme-linked immunosorbent enzyme-linked

22、 immunosorbent assayassay，ELISAELISA原理原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； 在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应；骤与固相抗原或固相抗体起反应； 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；检物

23、质的量成一定的比例； 加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。* *AgAg是酶标志抗原，是酶标志抗原，AgAg是未标志抗原，是未标志抗原，AbAb是特异性抗体，是特异性抗体，(F)(F)表示游离型的表示游离型的* *AgAg，(B)(B)表示结合型的表示结合型的* *Ag-AbAg-Ab。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的固相载体的固相载体良好的良好的ELIS

24、AELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。最常用的是聚苯乙烯。最常用的是聚苯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。也略高。ELISAELISA载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。载体的形式有小试管、小珠和微量反应板。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、固相载体的包被与封闭、固相载体的包被与封闭（1 1包被包被coatingcoating指将抗原或抗体连接到固相载体指将抗原或抗

25、体连接到固相载体上的过程。上的过程。以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于pH 9.6pH 9.6的碳酸盐缓冲液或的碳酸盐缓冲液或pH 7.2pH 7.2的磷酸盐缓冲液，的磷酸盐缓冲液，pH 7pH 78 8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液中，加满反应孔，置缓冲液中，加满反应孔，置44过夜，洗涤即可。过夜，洗涤即可。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被

26、浓度为0.10.12020g/mlg/ml。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2封闭封闭blockingblocking指继包被之后用高浓度的无关指继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的所有的ELISAELISA固相载体均需封闭。固相载体均需封闭。常用封闭剂有常用封闭剂有0.05%0.05%0.5% BSA0.5% BSA；10%10%小牛血清或小牛血清或1%

27、1%明胶明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用；脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用5%5%）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法4 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1 1稀释液用于稀释酶标抗体及标本。稀释液用于稀释酶标抗体及标本。常用中性常用中性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓冲液，其中含有无关高浓度缓冲液，其中含有无关高浓度蛋白如蛋白如1010动物血清、动物血清、1 1BSABSA牛血清白蛋白）、牛血清白蛋白）、1 1明胶等和非离子型表面活性剂如明胶等和非离子型表面活性剂如0.050.05Tween Tween 2020或或

28、TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2洗涤液一般与稀释液相同，常用洗涤液一般与稀释液相同，常用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲液。冲液。四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表7-27-2。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含E

29、DTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液常用的抗体稀释液和洗涤液第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3酶反应终止液酶反应终止液 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRPHRP反应终止液为反应终止液为2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H2SO4H2SO4HRPHRP在酸性条件下丧失酶活性）。在酸性条件下丧失酶活性）。很多很多ELISAELISA试剂采用碱

30、性磷酸酶试剂采用碱性磷酸酶APAP作为标记酶，用作为标记酶，用3mol/L NaOH3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法5 5、ELISAELISA法常用酶的底物系统法常用酶的底物系统ELISAELISA法对底物的要求：法对底物的要求：价廉易得、平安；价廉易得、平安；显色性和稳定性好；显色性和稳定性好；底物本身最好为无色物质；底物本身最好为无色物质；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；终止酶催化反应后，底物不应再继续地自发性变性；其最终产物可溶、易于测定及光吸收值高。其最终产物可溶

31、、易于测定及光吸收值高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1辣根过氧化物酶的底物系统辣根过氧化物酶的底物系统 常见底物有邻苯二胺常见底物有邻苯二胺OPDOPD，产物橙红色，测定波长，产物橙红色，测定波长492nm492nm）、）、5-5-氨基水杨氨基水杨酸 酸 5 - A S5 - A S ， 产 物 橙 色 ， 测 定 波 长， 产 物 橙 色 ， 测 定 波 长 5 5 0 n m5 5 0 n m ） 、） 、3,3,5,5-3,3,5,5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺TMBTMB，产物红色，测定，产物红色，测定波长波长450nm450nm）、）、2,2-2,2-连氮连

32、氮- -二二3-3-乙基苯并噻唑啉乙基苯并噻唑啉- -6-6-磺酸盐）（磺酸盐）（ABTSABTS等。等。ABTSABTS的反应曲线不好。的反应曲线不好。OPDOPD溶液具有光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变特溶液具有光敏性，相对来说不稳定，且具有诱变特性。性。TMBTMB的背景值低，溶液稳定，没有诱变特性。的背景值低，溶液稳定，没有诱变特性。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2碱性磷酸酶的底物系统碱性磷酸酶的底物系统 常用的底物为对硝基磷常用的底物为对硝基磷酸苯酯酸苯酯PNPPNP），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在可在405nm40

33、5nm处检测其吸光度的变化，该底物的转化效处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好。率高，线性关系好。用酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈用酚酞磷酸酯为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在红色，可在530nm530nm处光度法测定。处光度法测定。此外还可以百里酚酞单磷酸酯等为底物。此外还可以百里酚酞单磷酸酯等为底物。 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3-D-D-半乳糖苷酶的底物系统半乳糖苷酶的底物系统 常见底物有邻硝基常见底物有邻硝基苯苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷ONPGONPG），其水解的产物邻硝基苯），其水解的产物邻硝基苯酚在酚在40

34、5nm405nm处具有最大吸光度值。处具有最大吸光度值。其他的底物有对硝基苯其他的底物有对硝基苯-D-D-半乳糖苷半乳糖苷PNPGPNPG）、苯基）、苯基-D-D-半乳糖苷、氯酚红半乳糖苷、氯酚红-D-D-半乳糖苷半乳糖苷CPRGCPRG）、）、9-9-羟基羟基-3-3-异吩异吩噁噁唑酮唑酮-D-D-半乳糖苷半乳糖苷RGRG等。等。（4 4青霉素酶青霉素酶PNCPNC的底物系统的底物系统 常用底物有溴麝香常用底物有溴麝香草酚蓝草酚蓝BTBBTB）、青霉酮酸还原淀粉）、青霉酮酸还原淀粉- -碘复合物碘复合物SICSIC）、溴甲酚紫）、溴甲酚紫BCPBCP和溴麝香草酚蓝和溴麝香草酚蓝2 21 1等

35、。等。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法二、二、ELISAELISA酶联方法和试验方法酶联方法和试验方法1 1、ELISAELISA酶联方法酶联方法ELISAELISA酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。盐氧化法。（1 1戊二醛交联法戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，它戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。可以联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。戊二醛交联法有一步法、两步法两种。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNC

36、CNHHNCCNHHN+图图7-2 戊二醛一步法反应原理戊二醛一步法反应原理一步法一步法 将戊二醛直接将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记中，反应后即得酶标记抗体。抗体。该法操作简便、有效，重该法操作简便、有效，重复性好。复性好。缺点是交联反应是随机的缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。之间有可能交联。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法HCCHOONH2+CCNOHHCCNHHNNH2图图7-3 戊二醛二步法反应原理戊二醛二步法反应原理两步法两步法 先将酶与戊二醛先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的作用

37、，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以的酶与蛋白质是以1:1的的比例结合的，有助于本比例结合的，有助于本底的改善。底的改善。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法 本法只适用于含糖量较高的酶。本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRPHRP的标记常用此法。的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将反应时，过碘酸钠将HRPHRP分子表面的多糖氧化为活泼的

38、醛分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成基，可与蛋白质上的氨基形成SchiffSchiff氏碱而结合。氏碱而结合。图图7-4 7-4 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA试验方法试验方法ELISAELISA法中有三个必要试剂：固相抗原或抗体；酶法中有三个必要试剂：固相抗原或抗体；酶标记抗原或抗体；酶反应底物。标记抗原或抗体；酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。设计出各种不同类型的检测方法。如双抗体夹心法、间接

39、法、竞争法、异种动物抗体双夹如双抗体夹心法、间接法、竞争法、异种动物抗体双夹心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原直接包被法等方法。直接包被法等方法。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA由由ClarkClark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最经典的年建立，是最经典的ELISAELISA检测法。检测法。该法的灵敏度高，

40、特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。酶标记物要求技术性强，成本较高。该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-5 双抗体夹心法双抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2间接法间接法间接法间接法indirect ELISAindirect ELISA是最常用的是最常用的ELISAELISA检测方法检测方法

41、，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的受检抗体相结合。受检抗体相结合。该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。体检测各种与抗原相应的抗体。该方法不必为每个待测抗体或抗原制备特异性的酶该方法不必为每个待测抗体或抗原制备特异性的酶标抗抗体或酶标抗体），极大地简化了实验。标抗抗体或酶标抗体），极大地简化了实验。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-6 间接法间接法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3竞争法竞争法竞争法竞争法

42、competing ELISAcompeting ELISA是利用待测抗原和酶标抗是利用待测抗原和酶标抗原与特异性抗体竞争结合，或待测抗体和酶标抗体与原与特异性抗体竞争结合，或待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法图特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法图7-77-7）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-7 竞争法竞争法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（4 4异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法图异种动物抗体双夹心法图7-87-8），又称间接双抗体夹），又称间接双抗体夹心法心法indirect DAS-E

43、LISAindirect DAS-ELISA或三抗体夹心法或三抗体夹心法triple antibodies sandwichtriple antibodies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-8 异种动物抗体夹心法异种动物抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（5 5抗酶抗体法抗酶抗体法抗酶抗体法图抗酶抗体法图7-97-

44、9是利用免疫学反应而不是用化学是利用免疫学反应而不是用化学交联反应来制备酶结合物，常用交联反应来制备酶结合物，常用HRPHRP为标记酶作为抗为标记酶作为抗原免疫动物制备抗原免疫动物制备抗HRPHRP抗体。抗体。可用一种动物如兔制备特异性抗体第一抗体和可用一种动物如兔制备特异性抗体第一抗体和抗酶抗体第三抗体），再用另一种动物如羊制抗酶抗体第三抗体），再用另一种动物如羊制备抗第一种动物兔备抗第一种动物兔IgGIgG的抗体第二抗体）。的抗体第二抗体）。让这种抗让这种抗IgGIgG的第二抗体把第一抗体兔的第二抗体把第一抗体兔IgGIgG和抗酶抗和抗酶抗体也为兔体也为兔IgGIgG通过免疫学反应连接起来

45、。通过免疫学反应连接起来。最后让酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用而揭示在最后让酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法 优点优点:HRP:HRP通过免疫学反应与抗体结合，避免了用化学通过免疫学反应与抗体结合，避免了用化学方法交联时抗体活性的改变，也避免了方法交联时抗体活性的改变，也避免了HRPHRP与其他蛋与其他蛋白质分子结合，防止标记抗体和游离的未标记抗体之白质分子结合，防止标记抗体和游离的未标记抗体之间的竞争，提高了标记抗体的质量。间的竞争，提高了标记抗体的质量。 在纯化化学交联反应制

46、备的酶结合物的过程中，除去在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去未标记抗体比较困难，而且该法仅在制备抗酶抗体时未标记抗体比较困难，而且该法仅在制备抗酶抗体时用少量纯用少量纯HRPHRP作抗原，所以用较粗制的作抗原，所以用较粗制的HRPHRP与抗酶抗体与抗酶抗体形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大节约了价形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大节约了价格较昂贵的精制格较昂贵的精制HRPHRP。 因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多适用于检测动物中的抗体。多适用于检测动物中的抗体。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图

47、图7-9 抗酶抗体法抗酶抗体法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法三、三、ELISA反应条件的反应条件的选择选择1、酶标抗体浓度的选、酶标抗体浓度的选择择先用先用200L IgG100 mg/ml包被小孔，包被小孔，再将酶标记抗体球蛋再将酶标记抗体球蛋白系列稀释并加入小白系列稀释并加入小孔中，洗涤后，加底孔中，洗涤后，加底物反应，终止后测定物反应，终止后测定吸光度。吸光度。选择吸光度为选择吸光度为1的稀释的稀释度作为酶标抗体最适度作为酶标抗体最适浓度。浓度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、包被浓度的选择、

48、包被浓度的选择当包被抗原的浓度较低当包被抗原的浓度较低时，包被量随抗原浓时，包被量随抗原浓度的增加而增大；当度的增加而增大；当包被抗原达到一定浓包被抗原达到一定浓度后，包被量为定值度后，包被量为定值，不再随抗原浓度的，不再随抗原浓度的增加而增大。增加而增大。此浓度称为抗原的饱和此浓度称为抗原的饱和包被浓度。包被浓度。图图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反应的关系反应的关系 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法 表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对包被法中链霉素包被质量浓度对ELISAELISA实验误差的影响实验误差的影响

49、包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果（测定结果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、酶、酶- -底物反应时间的选择底物反应时间的选择抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在3737反应反应2 23h3h达到高峰。达到高峰。时间太短，敏感

50、性下降，时间太长，吸附的抗原或复合时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复合物在这个温度下可能脱落。物在这个温度下可能脱落。酶酶- -底物反应时间一般采用底物反应时间一般采用15min15min、30min30min或或45min45min，也可，也可以标准阳性血清为准，随时测定其以标准阳性血清为准，随时测定其ODOD值，当达到规定值，当达到规定的的ODOD值时，即终止反应。值时，即终止反应。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法四、四、ELISAELISA的定量计算与灵敏度的定量计算与灵敏度1 1、ELISAELISA的定量计算的定量计算一般采用分光光度计测定结合物中的酶量

51、和抗体蛋一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白白IgGIgG量，酶量和量，酶量和IgGIgG计算方法如下。计算方法如下。其中，其中，0.40.4表示酶的表示酶的A403nmA403nm值为值为1 1时，酶量为时，酶量为0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.42表示酶的表示酶的A403nmA403nm值为值为1 1时，其相应时，其相应A280nmA280nm值为值为0.420.42；0.620.62表示在表示在A280nmA280nm值为值为1 1时，时，IgGIgG量为量为0.62mg/ml0.62mg/ml；0.940.94表示酶、戊二醛结合后表示酶、戊二醛结合后，A280n

52、mA280nm增加约增加约6 6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 094. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法 酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法：酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法： 以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法：方法： 酶量为酶量为1mg/ml1mg/ml，摩尔比值为，摩尔比值为1.51.52.02.0，酶结合率在，酶结合率在30%30%以上时，可获得较好的以上时，可获得较好的ELISAELISA分析结果。分析结果。）结合物

53、溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）结合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）标志时加入的酶量（）结合物中酶量（酶结合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩尔比）（）分子量（）第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的灵敏度与的灵敏度与ELISAELISA放大系统放大系统（1 1ELISAELISA的灵敏度的灵敏度 ELISA ELISA的检出限已经达到的检出限已经达到10-810-810-12g10-12g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。，但对某些测

54、定仍需更高的灵敏度。传统传统ELISAELISA中显色剂发色团的吸光度是限制中显色剂发色团的吸光度是限制ELISAELISA灵敏度灵敏度的主要因素。的主要因素。改用荧光标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗改用荧光标记或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏度。体可以提高灵敏度。改变传统改变传统ELISAELISA的操作程序也可以提高灵敏度，如的操作程序也可以提高灵敏度，如SIMITSIMIT技术。技术。采用放大系统是提高采用放大系统是提高ELISAELISA灵敏度的主要途径。灵敏度的主要途径。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2ELISAELISA放大系统放

55、大系统 生物素生物素- -亲和素放大系统可增亲和素放大系统可增加抗体或抗原的标记率。加抗体或抗原的标记率。生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高K=1015K=1015），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。生物素对抗体和酶的标记率高生物素对抗体和酶的标记率高1010个生物素分子个生物素分子/ /抗体抗体分子），且生物素分子易于活化，标记后不影响抗体分子），且生物素分子易于活化，标记后不影响抗体和酶的活性。和酶的活性。每个亲和素分子能结合每个亲和素分子能结合4 4个生物素，因而可偶联更多的个生物素，因而可偶联更多

56、的联结生物素的酶分子，从而提高联结生物素的酶分子，从而提高ELISAELISA的敏感性。的敏感性。生物素生物素- -亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。适应不同的分析设计。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法微粒放大。用适当的微粒代替酶微粒放大。用适当的微粒代替酶- -抗体结合物也可以抗体结合物也可以获得放大效果。获得放大效果。每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包含微粒放大的夹心含微粒放大的夹心ELISAELISA法中，微粒通过结合于其上法中，微粒通过结合于

57、其上的第二抗体结合于抗原。微粒上又结合着标记酶，其的第二抗体结合于抗原。微粒上又结合着标记酶，其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大。例如，微颗粒放大系统用微颗粒硅胶直径约例如，微颗粒放大系统用微颗粒硅胶直径约40nm40nm作作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接。酶为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接。酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法

58、五、五、ELISA法的应用法的应用酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测，它的最小抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达可测值达ng甚至甚至pg水平。水平。酶免疫测定在各应用领域中的普及，应归功于商品酶免疫测定在各应用领域中的普及，应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。完整的完整的ELISA试剂盒应包含包被好的固相载体、酶试剂盒应包含包被好的固相载体、酶结合物、底物

59、和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定基因工程药品在生产过程中为防止污染，在细胞培基因工程药品在生产过程中为防止污染，在细胞培养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。青霉素在水溶液中很容易和蛋白质结合形成过敏性青霉素在水溶液中很容易和蛋白质结合形成过敏性杂

60、质青霉噻唑杂质青霉噻唑benzyl penicilloyl，BPO蛋白，蛋白，为确保基因工程药品的产品质量，可以用为确保基因工程药品的产品质量，可以用ELISA对基因工程药品中是否残存有青霉噻唑蛋白进行对基因工程药品中是否残存有青霉噻唑蛋白进行检测，其对样品中结合青霉素的绝对检出量小于检测，其对样品中结合青霉素的绝对检出量小于0.310-6。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法 其实验步骤如下：其实验步骤如下： （1 1包被：用碳酸缓冲液包被：用碳酸缓冲液0.1mol/L0.1mol/L，pH 9.6pH 9.6直直接包被待测抗原，接包被待测抗原，200L/200L/孔；孔； 包