含氮量的测定

1、第五节第五节 含氮量的测定含氮量的测定一、概述一、概述二、含氮量的测定方法二、含氮量的测定方法 （一）食品中的蛋白质含量在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉左右，猪肉中为中为9.5%，兔肉为，兔肉为21%，鸡肉为，鸡肉为20%，牛乳为，牛乳为3.5%黄鱼为黄鱼为17.0%，带鱼为，带鱼为18.0%，大豆为，大豆为40%，稻米为稻米为8.5%，面粉为，面粉为9.9%，菠菜为，菠菜为2.4%，黄瓜，黄

2、瓜为为1.0%，桃为，桃为0.8%，柑橘为，柑橘为0.9%，苹果为，苹果为0.4%和油菜为和油菜为1.5%左右。左右。 一、一、概述（二）测定意义（二）测定意义 1. 蛋白质是蛋白质是组成人体的重要成分之一组成人体的重要成分之一，人，人体的一切细胞都由蛋白质组成；体的一切细胞都由蛋白质组成； 2 .蛋白质维持蛋白质维持体内酸碱平衡；体内酸碱平衡； 3 .蛋白质是食品的重要组织部分之一，也蛋白质是食品的重要组织部分之一，也是重要的是重要的营养物质营养物质； 4 .蛋白质是评价蛋白质是评价食品质量高低的指标食品质量高低的指标，还，还关系到人体健康。关系到人体健康。 一、一、概述 不同的蛋白质其氨基

3、酸构成比例及方式不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，氮量也不同，一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为16%，即一，即一 份氮素相当于份氮素相当于6.25份份蛋白质蛋白质，此数值（，此数值（6.25）称为蛋白质系数。）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆及其制品为大豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为，牛乳及其制品为6.38。（三）蛋白质

4、换算系数（三）蛋白质换算系数（一）蛋白质测定方法概述（一）蛋白质测定方法概述 测定蛋白质的方法可分为两大类：测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用一类是利用蛋白质的共性蛋白质的共性，即含氮量、，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量肽键和折射率测定蛋白质含量 ； 另一类是利用蛋白质中另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定等测定蛋白质含量。蛋白质含量。 二、二、 蛋白质测定方法蛋白质测定方法 蛋白质的测定，目前多采用将蛋蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的蛋

5、白质含量的凯氏定氮法凯氏定氮法。不同食品。不同食品的蛋白质系数有所不同。的蛋白质系数有所不同。 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为作为标准检验方法标准检验方法。凯氏定氮法：凯氏定氮法：常量法、半微量法、微量法及经改进常量法、半微量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法，自动凯

6、氏定氮仪等。后的改良凯氏定氮法，自动凯氏定氮仪等。微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器套微量凯氏定氮器目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。（二） 凯氏定氮法

7、（国标法）凯氏定氮法凯氏定氮法通过测定食品中通过测定食品中N的含量，再乘以蛋白质系数，就可的含量，再乘以蛋白质系数，就可以得到蛋白质的含量以得到蛋白质的含量 而一般来说，食品中蛋白质的含氮量为而一般来说，食品中蛋白质的含氮量为16，所以，所以，测得的含氮量再乘以测得的含氮量再乘以6.25，就能得到蛋白质的含量。，就能得到蛋白质的含量。蛋白质含量25. 6%16NN1 1、原理、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨

8、与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。出蛋白质的含量。（二） 凯氏定氮法（国标法）过程反应方程2、仪器和试剂硫酸铜；硫酸铜； 硫酸钾；硫酸钾； 硫酸；含蛋白质试样硫酸；含蛋白质试样 40g/L硼酸溶液：硼酸溶液： 混合指示剂：混合指示剂：（国标）（国标）1g/L甲基红乙醇溶液与甲基红乙醇溶液与1g/L甲基蓝乙醇溶液，临用时按甲基蓝乙醇溶液，临用时按21的比例混合。的比例混合。或者或者1g/L甲基红乙醇甲基

9、红乙醇溶液与溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按临用时按1 5的比例混合；的比例混合； 400g/L氢氧化钠；氢氧化钠； 0.1mol/L盐酸标准溶液盐酸标准溶液3、步骤样品消化样品消化 蒸馏、吸收蒸馏、吸收 滴定滴定（1）消化准确称取固体样品准确称取固体样品0.22.0g，液体液体1020ml，置于，置于500ml凯凯氏烧瓶中。氏烧瓶中。加入硫酸铜加入硫酸铜0.5g，硫酸钾，硫酸钾10g，浓硫酸浓硫酸20ml，摇匀。，摇匀。置于电炉上，成置于电炉上，成45度角，小火度角，小火加热。加热。待泡沫停止后，加大火力，保待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变持微沸，至液体变蓝

10、绿色透明蓝绿色透明，再继续加热再继续加热0.51h，取下冷却，取下冷却后，小心加入后，小心加入20ml水，转移至水，转移至1000ml容量瓶，定容。容量瓶，定容。（1）消化一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%）（2）蒸馏、吸收按左图连接好装置，塞紧瓶口，按左图连接好装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶中有中有50ml4硼酸和混合指示硼酸和混合指示剂剂）。放松夹子，加入）。放松夹子，加入7080ml氢氧化钠氢氧化钠溶液，至瓶中溶溶液，至瓶中溶液变为液变为深蓝色或产生黑色沉淀，深蓝色或产生黑色沉淀，再加入再加入100ml蒸馏水蒸馏水，夹紧夹子，夹紧夹子，加热蒸馏，

11、至加热蒸馏，至氨全部蒸出氨全部蒸出（250ml）。）。（3）滴定将上述吸收液用将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准盐酸标准溶液直接滴定至溶液直接滴定至蓝色蓝色变为微红色变为微红色即为终点，即为终点，记录盐酸用量。记录盐酸用量。（4）计算 乳制品K=6.38（N=15.7%） 小麦粉K=5.79（N=17.6%）动物胶K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16%） K-换称等数100014. 0mFcVW4、注意事项（1 1）所用试剂溶液应用）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配置。配置。（2 2）样品应是）

12、样品应是均匀的均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。样品应振摇或搅拌均匀。（3 3）当）当取样量较大取样量较大时，如干试样超过时，如干试样超过5g5g，可按每可试样，可按每可试样5ml5ml的比例的比例增加硫酸用量增加硫酸用量。（4 4）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中被消耗或样品中脂肪含量过高时脂肪含量过高时，要，要增加硫酸增加硫酸的量。的量。（5 5）样品放入定氮瓶内时，）样品放

13、入定氮瓶内时，不要沾附颈不要沾附颈上，万一沾附可上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低偏低。 （6）在整个消化过程中，不要用强火，保持）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓和缓的沸腾的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。（7）消化时如）消化时如不容易不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入冷后，慢慢加入30%过氧化氢过氧化氢2-3ml，促使氧化。，促使氧化。（8）一般消化液呈透明

14、蓝绿色（或蓝色或浅绿色）一般消化液呈透明蓝绿色（或蓝色或浅绿色）后继续消化后继续消化30分钟即可。但对于含有分钟即可。但对于含有难氨化的含氮难氨化的含氮化合物化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需要酸或脯氨酸等时，需要适当延长消化时间适当延长消化时间。含铁量。含铁量多时，呈深绿色。多时，呈深绿色。（9）加入）加入硫酸钾硫酸钾的作用为升高的作用为升高溶液的沸点溶液的沸点，硫酸硫酸铜铜为为催化剂催化剂，硫酸铜可作为，硫酸铜可作为消化结束消化结束时时指示剂指示剂，硫，硫酸铜在酸铜在蒸馏时蒸馏时作碱性反应的作碱性反应的指示剂指示剂。（10）

15、蒸馏前如加碱不足，消化液呈蓝色不生成）蒸馏前如加碱不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需增加氢氧化钠用量。向蒸氢氧化铜沉淀，此时需增加氢氧化钠用量。向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物Cu(NH3)42+（11）蒸馏装置）蒸馏装置不能漏气不能漏气。（12）蒸馏结束时，使冷凝管）蒸馏结束时，使冷凝管下端离开

16、液皿下端离开液皿，用，用少量水冲洗少量水冲洗冷凝管冷凝管下端外部下端外部，再蒸馏再蒸馏1min，然后，然后关闭热源关闭热源，否者可能造成吸收液倒吸。，否者可能造成吸收液倒吸。 （13）氨是否完全蒸馏出来，可用）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试纸试馏出试馏出液是否为碱性。液是否为碱性。（14）吸收液也可以用）吸收液也可以用0.01当量的酸代替硼酸，过剩当量的酸代替硼酸，过剩的酸液用的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗为试剂空白消耗碱液数，碱液数，B为样品消耗碱液数，为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余为碱液浓度，其余均相同。均相同。（15）以硼酸为氨的吸收液，

17、可省去标定碱液的操作，）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。作比较简便。（16）硼酸吸收液的）硼酸吸收液的温度不应超过温度不应超过40度度，否则对氨的，否则对氨的吸收作用减弱，而造成损失，此时可置于吸收作用减弱，而造成损失，此时可置于冷水浴冷水浴中使中使用。用。（17）混合指示剂混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

18、甲基红乙醇溶液。（三） 微量凯氏定氮法1.原理与常量凯氏定氮法相同原理与常量凯氏定氮法相同2.步骤 采样（采样（固体采样固体采样、液体采样液体采样） 样品预处理样品预处理 样品分析样品分析 样品数据处理样品数据处理 撰写分析报告撰写分析报告（四）自动凯氏定氮仪全自动凯氏定氮仪全自动凯氏定氮仪生产厂家生产厂家：FOSS 福斯福斯产品型号：产品型号：K2300 技术参数：技术参数： 数据储存：数据储存：200个样品的数据个样品的数据 蒸馏时间：蒸馏时间：3.5分钟分钟/样品样品(30mg)（仅蒸馏时用）（仅蒸馏时用） 循环时间：循环时间：4.5分钟分钟/样品样品(30mg氮氮)1升升/每分钟，每分

19、钟，15 C水温。水温。测定范围：测定范围：0.1-200毫克氮毫克氮重重 现现 性：性：1%相对误差（包括消化步骤相对误差（包括消化步骤)回回 收收 率：率：99.5-100%滴定精度：滴定精度：3.8ul /步，最快步，最快40ml/分钟分钟试剂体积：试剂体积：0-150ml , 10ml /级级延延 时：时：0-999秒秒电力供应：电力供应：220V，50/60 HZ 仪器主要特点仪器主要特点： 全新长寿命设计，高级微机智能控制，大荧屏显示，菜单式人机对话操作，高精度（全新长寿命设计，高级微机智能控制，大荧屏显示，菜单式人机对话操作，高精度（3.8ul/滴）智能调速滴）智能调速滴定系统以

20、及全面运行监控系统，采用国家滴定系统以及全面运行监控系统，采用国家/国际标准法国际标准法颜色指示法检测终点，自动化程度高（消化好的样品直接上机自动颜色指示法检测终点，自动化程度高（消化好的样品直接上机自动完成分析和计算全过程），稳定可靠，运行成本低，最大限度地保证操作人员的安全及结果的准确性和精度。检测结果（完成分析和计算全过程），稳定可靠，运行成本低，最大限度地保证操作人员的安全及结果的准确性和精度。检测结果（12种种表示法）直接在显示屏显示及打印。内置的计算机可将检测数据向表示法）直接在显示屏显示及打印。内置的计算机可将检测数据向PC机及机及LIMS系统转移。系统转移。 应用范围：应用范围

21、： 对原料、成品和半成品中的含氮和总氮含量的测定对原料、成品和半成品中的含氮和总氮含量的测定( (五五) )蛋白质的快速测定法蛋白质的快速测定法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：新开发的：双缩脲法、双缩脲法、 紫外分光光度法、紫外分光光度法、 染料结合法、染料结合法、 水杨酸比色法等水杨酸比色法等。下面简单介绍双缩脲法下面简单介绍双缩脲法1.原理原理 脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2 加热至加热至150160时，两分子缩和成双缩脲。时，两分子缩和成双缩脲。

22、双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2（六）氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定1.甲醛滴定

23、法2.茚三酮的比色法1.1.甲醛滴定法甲醛滴定法（1）原理：氨基酸本身有碱性）原理：氨基酸本身有碱性 NH2 基，又有酸性基，又有酸性 COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定COOH 基。基。（2）适用范围：适用于发酵工业，如发酵液）适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。食品中游离氨基酸的测定等。（3）试剂）试剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用

24、氢氧化钠将用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性红中性红50%乙醇溶液，乙醇溶液， 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。（3 3）操作：同时取两份样：）操作：同时取两份样： 一份中加一份中加中性红指示剂中性红指示剂，用氢氧化钠直接，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它滴，中和样液中其它酸性物质酸性物质。 另一份中加另一份中加百里酚酞百里酚酞、中性甲醛用、中性甲醛用NaOH NaOH 滴，滴，中和了样液中中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和质的总和。 二者之差可计算氨基酸含量。二者之差可计算氨基酸含量。2.2.茚三酮的比色法茚三酮的比色法原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。1.1.薄层色谱法薄层色谱法2.氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法3.气相色谱法气相色谱法4.高效液相色谱法高效液相色谱法（