开题报告丁小红毕业设计论文开题报告

1、杭 州 师 范 大 学本科生毕业设计（论文）开题报告题 目 Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定 学 院 生命与环境科学学院 专业班级 生技142 学生姓名 丁小红 学 号 2014214138 指导教师 盛东来 职 称 讲师 一、选题背景与意义（说明所选课题的历史背景、国内外研究现状和发展趋势） 小鼠作为哺乳动物遗传研究中首选的模式生物。经过过去几十年的努力，培育基因打靶和转基因小鼠已经变成很平常的工作，以目前的技术可以获得在核酸水平上的突变品系。现在，诸如此种基因组修饰变得越来越精细，而在基因水平上标记不同的细胞群已成为非常普遍的

2、研究。 Lac Z，即细菌-半乳糖苷酶基因在许多小鼠研究中作为筛选标记，它是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。 GFP,即绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein )其自身的特点，它能够在体内或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势，能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进

3、行定量检测。目前，人们已经改进了野生型GFP基因，从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP（EGFP）就是其中之一。现在，它已普遍应用于转基因或基因打靶小鼠。更为重要的是，人们现在已经开发出多种GFP光谱变体，其中两种全新颜色的变体增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和增强型蓝绿色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已应用于小鼠研究中。 由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠，所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色，这对体内双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的

4、应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法，代表着小鼠基因组改造技术的未来发展方向，并开启了在同一个动物体内应用组合无创性报告基因的广阔前景。 因此本文将通过Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定。 二、研究的基本内容和拟解决的主要问题研究基本内容： 小鼠解剖、DNA采集与提取、引物设计、基因片段PCR，琼脂糖凝胶电泳 拟解决的主要问题： 作为导师研究课题的一部分，完成基因型鉴定后为后续实验奠定基础。 三、研究方法及措施（拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等）1、小鼠解剖： （1）准备实验工具（PBS缓冲液、培养皿、解剖工具等）；

5、（2）捏住母鼠尾巴中部将母鼠提起，置于鼠笼上，用颈椎脱臼法处死； （3）用75%酒精喷壶喷湿母鼠腹部皮毛，在培养皿中倒入PBS缓冲液； （4）用镊子提起母鼠腹部皮肤，用剪刀横向剪一个创口，撕开； （5）用剪刀剪开腹腔膜，用镊子取出子宫，移至培养皿中； （6）在体视显微镜下操作，用镊子撕开子宫及羊膜，分离胚胎； （7）将胚胎移至干净PBS缓冲液中，剪尾做DNA提取； 2、DNA采集与提取： DNA采集 （1）剪取小鼠尾巴约0.3里面置EP管备用； （2）解剖小鼠取视网膜、内耳、血液、心肌、皮肤等组织部分置EP管备用。 DNA提取 方法一：碱裂解法 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管

6、（2）加入100ul 50M NaOH （10ml stock of 50mM NaOH=9.95ml ddH20+50ul 10N NaOH） （3）95加热10分钟，涡旋 （4）加入10ul 1M Tris（PH=8.0），涡旋 （5）12000g离心5分钟 （6）加入100ul TE（PH=8.0） 方法二：蛋白酶消化 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管 （2）加入400ul Tail digestion buffer及2-5ul 10mg/ml proteinase K （3）60加热，过夜 （4）加入200l酚氯仿异丙醇溶液，涡旋至乳白色，14000g离心5分钟 （5）吸

7、取300ul上清液至新EP管，加入900ul 100%乙醇，摇动4-6次， 14000g离心1分钟 （6）倒去上清液，加入350ul 75%乙醇，14000g离心1分钟 （7）倒去上清液，自然风干 （8）加入50ul TE（PH=8.0） 蛋白酶k是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，是枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到，用于生物样品中蛋白质的一般降解。 3、引物设计： 本次实验所用引物由美国罗切斯特大学甘霖教授完成。 4、基因片段PCR： （1）高温变性（95） （2）低温退火（60） （3）室温延伸（72） 5、琼脂糖

8、凝胶电泳： （1）配制1X TAE缓冲液（附录） （2）制作琼脂糖凝胶：根据引物大小配制（600bp以下2%，600bp以上1.5%） 例：制作2%凝胶100ml 电子天平称取琼脂糖2g于锥形瓶中，加入100ml 1X TAE缓冲液（实际多于100ml，以免煮胶时蒸发升高凝胶浓度），锥形瓶加纸盖，摇匀，置微波炉中加热，直到凝胶溶液完全透亮，加入3ul genegreen核酸染料,摇匀。 （3）倒入已插入梳子的胶槽（中孔梳子薄面朝下）冷却。 （4）10-15分钟后将凝胶放入电泳槽中。 （5）用移液枪将PCR产物加到对应的胶孔中，每孔约7ul。 （6） 再将Marker（DM5000）加入其中一孔

9、，约4ul。 （7）开始电泳，本实验用恒压电泳，一般为180V，跑至大约2CM即可停止。 （8）将跑完的凝胶放入凝胶成像仪 LAS-3000进行成像分析，使用核酸染料GelGreen程序。 四、研究工作的步骤与进度（课题研究在时间和顺序上的安排）1 2016.1-2016.2 设计引物 2 2016.3-2016.4 基因型鉴定 3 2016.4 撰写论文 五、主要参考文献（作者、书名、论文题目、出版社或出版号、出版年月或出版期号。文科不得少于15篇，理科不得少于10篇，其中外文文献应不少于2篇）1Ting, D. T., Kyba, M. and Daley, G. Q. (2005). I

10、nducible transgene expression in mouse stem cells. Methods Mol. Med. 105, 23-46. 2Warchol, M. E. (2011). Sensory regeneration in the vertebrate inner ear: differences at the levels of cells and species. Hear. Res. 273, 72-79. 3Zheng, J. L. and Gao, W.-Q. (2000). Overexpression of Math1 induces robus

11、t production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat. Neurosci. 3, 580-586. 4Li, M., Pevny, L., Lovell-Badge, R. and Smith, A. (1998). Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr. Biol. 8,971-974. 5Ruben, R. J. (1967). Development of the

12、 inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. 220, 1-44. 6 Luo XJ, Deng M, Xie X, et al. GATA3 controls the specification of prosensory domain and neuronal survival in the mouse cochlea. Hum Mol Genet, 2013(22):36093623. CrossRef Medline 7 Colland, F., Jacq

13、, X., et al. Functional proteomics mapping of a human signaling pathway. Genome Res, 2004(14), 13241332.8Mead PE, Deconinck AK, Huber TL, et al. 8 Primitive erythropoiesis in the Xenopus embryo: the synergistic role of LMO-2, SCL and GATA-blinding proteins. Development, 2001(128):2301-2308 9Min Deng

14、, Xiong-jian Luo, Ling Pan, et al. LMO4 Functions As a Negative Regulator of Sensory Organ Formation in theMammalian Cochlea. The Journal of Neuroscience,2014(30):10072-10077. 10 Ge XM, Liu SHH, Lu Y, et al. Gene expression of Lhx4 during peripheral nerve regenerat ion in adult rats J . Progress in Natural Science, 2002, 12( 6) : 645-647. 葛学铭, 刘淑