抗糖尿病药物通过cdk5抑制肥胖相关的PPARγ磷酸化

1、抗糖尿病药物通过cdk5抑制肥胖相关的PPAR磷酸化在小鼠中, 高脂饮食诱导的肥胖能够激活脂肪组织中的细胞周期素依赖性激酶5( Cdk5), 从而使得调控脂肪形成和脂肪细胞基因表达的过氧化物酶体增殖物激活受体􀀁( PPAR) 第273位的丝氨酸磷酸化。这种修饰并不影响PPAR的脂肪形成能力, 但导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化, 如胰岛素增敏激素，脂联素( adiponectin)的表达减少。Cdk5对PPAR的磷酸化作用可被具有抗糖尿病作用的PPAR配体( 如罗格列酮和MRL24)所阻断。这种抑制作用在体内和体外均有效, 且完全不依赖经典的受体转录激活途径。在肥胖

2、病人中, 罗格列酮抑制PPAR磷酸化与其抗糖尿病作用密切相关。综上所述, 该研究表明Cdk5介导的PPAR磷酸化可能参与了胰岛素抵抗的发病机制, 同时揭示了通过PPAR改良抗糖尿病药的可能性。 脂肪组织处于代谢综合征治疗研究的中心地位。过多的身体脂肪被叫做肥胖，可以导致胰岛素抵抗，脂代谢紊乱，2型糖尿病，某些癌症和心血管疾病等。对于联系这一系列病理过程与脂肪组织生物学的分子机制的研究，具有最重要的科学和医学价值。脂肪细胞和组织可以分泌一系列的细胞因子和细胞因子样分子，称之为脂肪因子，它们对胰岛素敏感性，脂循环水平，以及食欲都有正面或负面的影响。在肥胖的人体内，脂肪组织分泌肿瘤坏死因子-（TNF

3、-），白细胞介素-1（IL-1），和抵抗素，从而抑制周边组织中胰岛素的作用。相反地，在瘦的个体体内，脂肪组织分泌的脂联素含量会比在肥胖个体中的高，这是一种循环蛋白，在肝脏和其它组织内具有胰岛素增敏作用。PPAR的作用核受体PPAR可以看作是脂肪细胞生物学和细胞分化的“主控”基因，对于将成纤维细胞前体细胞转化为脂肪细胞既是必要条件又是充分条件。其他关键的转录因子，如C/EBP（CAAT区/增强子结合蛋白）和EBF蛋白（早期B细胞因子early B-cell factor）则调控着PPAR的表达。噻唑烷二酮类化药物（如罗格列酮和吡格列酮）是合成的，作为强效激动剂作用于PPAR的配体，并且是强效的胰

4、岛素增敏剂。虽然这些药物胰岛素增敏作用的结构机制还不清楚，但它们都可以使那些能诱导胰岛素抵抗产生的脂肪因子的表达减少，如肿瘤坏死因子-（TNF-），白细胞介素-1（IL-1），和抵抗素等，并且增加胰岛素增敏激素，脂联素的生成。不幸的是，PPAR激动剂对于某些病人的健康有着长期的不良反应，如体重增加，液体滞留，并能增加心力衰竭的风险性。 PPAR作用的某些重要方面仍然令人不解，且尚待解决。首先是，在肥胖或胰岛素抵抗状态下，并不存在普遍的PPAR功能缺陷。因此，并不清楚为什么合成的受体激动剂有如此显著的抗糖尿病作用。第二，虽然PPAR配体药物的抗糖尿病效价强度，与它们与受体亲和力紧密相关，但某些完

5、全激动剂，如罗格列酮，有着良好的胰岛素增敏活性，但是，其它一些弱活性化合物，如苯甲基吲哚类MRL24，却仍有非常好的抗糖尿病作用。我们的研究显示，Cdk5对PPAR的磷酸化作用，既不激动也不抑制一般受体的转录活性，却使特定基因的表达改变，如脂联素基因。在小鼠中，Cdk5介导的PPAR的磷酸化作用与高脂饮食诱导的肥胖有关。某些抗糖尿病作用PPAR配体，它们的作用不在于有无激动活性，而是直接抑制Cdk5对PPAR的作用，使基因表达向正常的非糖尿病状态恢复。此外，在人体内，罗格列酮对PPAR磷酸化的抑制作用与它的抗糖尿病作用密切相关。这些不同寻常的药理特性，揭示了一个惊人的事实：肥胖糖尿病的Cdk5

6、-PPAR相关病理机制模型，以及PPAR配体在这些疾病中的治疗作用的相关机制。Cdk-5 在体内外均可使PPAR第273位丝氨酸磷酸化脂肪细胞以及脂肪组织周围的免疫细胞均可以分泌促炎症细胞因子，特别是当人体或动物肥胖时。我们注意到，PPAR的主要的氨基酸序列都含有一个一致性结合位点，用于Cdk-5使PPAR第273位丝氨酸磷酸化（如图.la补充）。CDK5并不受细胞周期素的调控，但是被p35/25（Cdk5的两个神经特异性调节亚基）所激动，后者又是许多细胞因子和许多促炎性因子的靶点。当用Cdk-5和它的辅助因子p35在体外培养小鼠的PPAR（图.la），这种核受体与组蛋白H1一样的被磷酸化，组

7、蛋白H1是一种已知的Cdk-5/p35复合物的底物.如第273位的丝氨酸突变成丙氨酸，则Cdk-5介导的磷酸化作用将完全被阻断，这说明在PPAR上，已经没有可由识别Cdk-5磷酸化一致性结合位点的抗体能检测到的其它的Cdk-5结合位点（图.la）。Cdk蛋白家族的其它成员并不磷酸化PPAR（如图.l b补充）。在细胞中，Cdk-5仍然可使PPAR第273位丝氨酸磷酸化，用CDK5激酶与突变型和野生型PPAR进行共转染实验可证明（如图.l c补充）。最后，Cdk-5并不影响小鼠的PPAR和PPAR（如图.l d补充）。 肥胖可表现为体循环内和局部的促炎症细胞因子以及游离脂肪酸水平增高，而Cdk-

8、5可以被许多的细胞因子所激动。如图1b所示，使用肿瘤坏死因子-对3T3-L1前脂肪细胞进行干预，可导致PPAR第273位丝氨酸磷酸化。而且，用IL-6或游离脂肪酸(FFAs )干预脂肪细胞时，也会发生PPAR第273位丝氨酸磷酸化（如图.2a和b补充）。这些修饰，能被与小鼠Cdk-5相对的短发夹型RNA(sh RNA) (如图.1c a和图.2c补充)，以及抑制剂，Cdk-5选择性抑制剂(Fig.2d补充)极大地抑制。虽然细胞因子和游离脂肪酸也可以作用于PPAR上其它的磷酸化位点，这些结果可以强有力的证明，PPAR第273位丝氨酸磷酸化是特异性的由Cdk-5介导。 我们接下来探讨，PPAR第2

9、73位丝氨酸磷酸化是怎样影响受体的活性，从而影响不同脂肪细胞内的脂肪形成和基因表达。在原设计完全缺乏这种受体的纤维母细胞中进行表达时(如图1d，如图4a补充)，野生型PPAR和S273A等位基因突变的PPAR对PPAR效应器拥有同样的转录活性(如图3补充)。这些初步实验，都利用了培养细胞中具有较高的Cdk-5活性的血浆水平。当用细胞因子和游离脂肪酸对这些细胞进行干预，可以产生更强的Cdk-5激动作用，并且这些干预也可导致脂肪细胞的脱分化现象（已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成

10、为具有未分化特性的细胞）。突变型PPAR与野生型PPAR等位基因对PPAR介导的脂肪形成有着同样的效用(Fig. 1e)。虽然大多数经典的脂肪细胞选择性基因，如aP2和C/EBP的表达水平相同，但某些转录蛋白如关键的脂肪酸转运蛋白cd36和脂肪因子，如脂联素，脂肪酶，以及瘦素对PPAR中Cdk-5的位点突变十分敏感(Fig. 1e).。在培养基中，Cdk5位点的突变也可以使脂联素的分泌增加(Supplementary Fig. 4b)。为了研究第273位丝氨酸是怎样调节脂联素和其他特定基因的表达，我们对磷酸化的PPAR以及非磷酸化的PPAR的相关核染色质进行了比对(Supplementary

11、Fig. 5)。PPAR磷酸化作用的DNA结合并没有明显差异，提示有其他的影响因素，如PPAR的共同调节，可能以不同的磷酸化依赖性方式进行调节。我们接下来比较了野生型和突变型PPAR等位基因体内调节脂肪细胞基因表达的能力。与野生型PPAR相比，在表达突变型PPAR的移植脂肪垫中，脂联素与脂肪酶的表达被显著的提高(Fig.1f)。然而，在表达突变型受体的细胞中，cd36与瘦素的表达仅有轻微的升高，并没有统计学意义。 值得注意的是，肥胖症患者中脂联素与脂肪酶的调节失衡。这是我们怀疑PPAR的Cdk-5修饰是否是由肥胖小鼠中的脂肪组织所激动。脂肪组织是从小鼠身上手术取得，这些小鼠或经标准饮食或经高脂

12、肪/高糖饮食（60的热量来自于脂肪）饲养。如补充表1中的，在第13周时出现明显的高脂血症。在标准饮食的动物中，建立PPAR第273位丝氨酸磷酸化可检测的基础水平，继而用高脂肪食物饲养3周，并没有发现这种修饰的增高(Fig. 2a, Supplementary Fig. 6a)。在7周的高脂饮食后，PPAR磷酸化程度相对于标准饮食小鼠，有所增高，在13周后这种差异变得更加明显。同样地，在以高脂饮食饲养3周的小鼠中，并未检测到Cdk-5的磷酸化作用，但是，在7或13周的的高脂饮食后，Cdk5的激活很容易检测到，并且伴随着p25蛋白水平的增高，它是一种CDK5活化亚基更稳定的形式(Supplemen

13、tary Fig. 6c)。我们同时也在两种不同的白色脂肪组织中，对Cdk5介导的PPAR磷酸化作用进行比较：一种是腹股沟的脂肪，属于皮下脂肪的一种，另一种是附睾脂肪，内脏脂肪组织的一种。如图2b和图6b及d补充所示，在两种白色脂肪中Cdk5介导的磷酸化作用都增加，在附睾脂肪中增加程度更高。抗糖尿病PPAR配体对PPAR磷酸化的阻滞噻唑烷二酮类的抗糖尿病药物，如罗格列酮，是PPAR的激动剂配体，对人和小鼠都能增加胰岛素敏感性。为了探究抗糖尿病PPAR配体是否能改变Cdk5介导的这种受体的磷酸化，我们用肿瘤坏死因子-，罗格列酮或两者合用干预脂肪细胞内野生型PPAR的表达。如图3所示，罗格列酮在大

14、约1M（微摩尔）时即抑制第273位的磷酸化，在脂肪细胞中PPAR介导的其它的活动也需要相似的剂量。GW9662，一种PPAR的拮抗剂，可完全阻滞罗格列酮的作用。我们研究了这些化合物对自然突变的PPAR(Q286P)的Cdk5介导的磷酸化的影响，这种PPAR不再与已知的配体结合。假设抑制必须要求配体的直接结合，那么在这种情况下，Cdk5的磷酸化作用则不受罗格列酮影响。为了确定是否是配体的直接作用引起了对Cdk5介导磷酸化的抑制，我们在达到体外可修饰的条件下，将精制的PPAR，cdk5/p35复合物，以及罗格列酮混合。罗格列酮可在体外阻断第273位的磷酸化，半大效应剂量是30nM (Fig. 3b

15、)，近似于这种化合物与PPAR结合的Kd（亲和力指数）。重要的是，这种抑制作用并不是由于cdk5活性被抑制而导致的，因为罗格列酮在潜伏期并不能抑制Cdk5磷酸化蛋白的活性(Fig. 3c).MRL24是一个对PPAR具有高亲和力的非噻唑烷二酮类化合物，在小鼠中具有极好的抗糖尿病活性，但在PPAR转录以及脂肪形成分析中具有很低的激动活性。如先前和图3d所示，MRL24与罗格列酮相比显现出的转录活性较低。另一方面，无论在体外还是在细胞内(Fig. 3b, Supplementary Figs. 7a and b)，MRL24在阻断Cdk-5介导的PPAR磷酸化方面十分有效(Fig. 3b)，30n

16、M的MRL24对PPAR修饰的阻断作用即相当于300nM的罗格列酮的作用。我们同时也比较了几种已使用的激动活性低但在体内抗糖尿病活性强的PPAR配体。如图8补充所示，Mbx-102, BVT.13以及 nTZDpa对抑制Cdk5介导的PPAR磷酸化均有效。 为了系统地比较由PPAR273位丝氨酸突变和特异性PPAR受体导致的基因表达变化，我们用细胞表达的RNA进行基因表达的Affymetrix分析，包括野生型和突变型细胞，同时对细胞进行罗格列酮或MRL24干预。如图3e所示，这些数据的自动积聚形成了几个令人感兴趣的表达簇。突变形式的PPAR和PPAR配体之间的基因表达全局调控中的重叠十分显著(

17、p<0.005 药物对突变型)。野生型与突变型PPAR之间存在不同表达的基因可以分为四个主要类型。第一类，称之为“a”，是那些有第273位丝氨酸基因突变而表达减少的基因。罗格列酮和MRL24都可抑制这一组基因，虽然这两个配体不似非磷酸化突变型PPAR的作用显著。这是可以理解的，因为与突变蛋白相比，配体作用不不可能引起PPAR的完全非磷酸化。另一簇较小的，称之为“b”，包括Ahnak核蛋白，蛋白脂质蛋白(plp)1，它对髓鞘形成十分重要，以及sorting nexin 5 (Snx5)，对囊泡运输有重要的意义。另一簇较大的，称之为“c”，是Cdk5介导的PPAR磷酸化导致减少的基因。在肥胖

18、时，已知某些基因失调，如脂联素和脂肪酶，属于这一簇。罗格列酮基本上可使所有的基因表达增加，但是如Fig. 3e所示，这种情况只是罗格列酮作用引起大量基因表达增加中的一部分。实际上，罗格列酮诱导程度最大的基因（称之为“d”）并不是与Cdk-5突变诱导基因一致 的基因，而是，大量的脂肪形成过程的经典基因，如aP2和脂蛋白脂肪酶(Lpl)。作为鲜明对比由MRL24诱导增强的基因簇比罗格列同诱导的少得多，但与PPAR的Cdk5突变位点基因有着非常好的一致性。综上所述，图13所视的数据说明，PPAR的Cdk5修饰是基因失调以及肥胖症脂肪组织病变的主要来源。为了直接证明这些，使用基因表达的主成分分析(Su

19、pplementary Fig. 9)，我们找到了PPAR的Cdk5修饰所调节的精确基因，如图3f所示，在肥胖的生活方式下，这些基因中很大一部分都失调。总的来说，17种基因中的大多数可以明显地减少Cdk5的PPAR磷酸化，至少在肥胖小鼠中有12种减少。有趣地是，大多数这些基因对附睾脂肪组织的影响都比腹股沟脂肪更显著(Supplementary Fig. 10)，包括在俩种脂肪组织中的不同的PPAR磷酸化(Fig. 2b).。此外，细胞中Cdk5的shRNA-mediated knock-down使得这些基因位点显著失调，特别是脂联素和脂肪酶(Supplementary Fig. 11)，进一步

20、证明了Cdk5介导的PPAR磷酸化特定脂肪细胞基因的调控中扮演着重要的作用。为了进一步从结构上了解PPAR配体是怎样影响Cdk5介导的PPAR磷酸化，我们进行与质谱分析法相关的氢/氘交换。如图4a所示，罗格列酮，而不是MRL24，明显减少了螺旋结构12中的H/D交换，包括传统激动剂作用受体的AF-2表面的配体结合区域组成部分。另一方面，MRL24从H3 (aa 309315)，369-379的-折叠以及PPAR第273位丝氨酸的Cdk5位点本身，对H/D交换动力学有更显著的影响。罗格列酮也可以通过H3，-折叠区域影响交换，但不能明显地改变第273位丝氨酸的H/D交换。当这些HDX映射到各种配体

21、结合的PPAR已知的晶体结构上，可以清楚的看到MRL24减少这些区域的动态性，比罗格列酮的程度要强的多(Fig. 4b)。可能是诱导减少H3, -折叠以及Cdk5位点的动态性，以对Cdk5磷酸化不利的结构形式冻结这个区域。因为CDK5的PPAR磷酸化不影响染色质对这种受体的入住(Supplementary Fig. 2)，我们核实了Cdk5位点附近区域可能是配体-门共调作用的重要位点的可能性。如图12补充所示，HDX数据显示出一个共激活模型，SRC3，作用于一个远离螺旋结构12的PPAR区域，当MRL24结合时，在第273位丝氨酸附近。因此，在丝氨酸273位修饰PPAR的特异性共调节有高度可行

22、性。 PPAR磷酸化与胰岛素抵抗相关 接下来，我们提出PPAR配体是否在体内改变Cdk5介导的PPAR磷酸化。如图5a和图13补充所示，用10 mg/kg的罗格列酮或MRL24治疗7天，高脂饮食的小鼠对葡萄糖的耐受性明显增加，并且在不改变体重的情况下降低空腹胰岛素水平。重要的是，对于几乎每一只治疗小鼠，这两种化合物均能降低脂肪组织中的Cdk5介导的PPAR磷酸化(Fig. 5b)。这些药物并不影响另一种已知磷酸化位点的状态，第112位丝氨酸(Supplementary Fig. 14)。而且，Cdk5作用于PPAR，最显著控制的17个基因中的12个都被这两个药物中的一个或两个所改变(Fig.

23、5c).。这些数据证明抗糖尿病PPAR配体在体内可抑制Cdk5的PPAR磷酸化，并且逆转与这个修饰相关的基因表达。与这些结果一致，抑制剂的干预明显抑制了Cdk5介导的磷酸化，以及调控PPAR磷酸化的大多基因(Supplementary Fig. 15)。然而，我们并不能排除治疗组中体重减少导致磷酸化和基因表达改变的可能性。 最后，我们研究用PPAR配体治疗的情况下，人体脂肪组织中Cdk5位点的PPAR磷酸化是否减少，以及这与机体胰岛素敏感性提高有什么关联。刚诊断出糖尿病的病人，对糖尿病的控制，可以使用药物也可以采用饮食疗法，锻炼，或减肥的方法。当PPAR磷酸化由肥胖诱导时，减肥也可以影响它。因

24、此，在治疗前和治疗后，每一个用罗格列酮治疗的病人，可以充当自我对照。如图5d所示，在罗格列酮治疗下，病人的皮下脂肪中，PPAR在第273位丝氨酸的磷酸化明显减少。但是，在一位病人中出现了磷酸化增加，两位病人中只有适量的降低。值得注意地是，PPAR磷酸化减少程度低或没有的病人，罗格列酮治疗的临床指标如空腹胰岛素和空腹血糖水平也只有很低的改善(Supplementary Tables 2 and 3)。为了研究这些反应与胰岛素敏感性之间的关系，we compared the final, euglycemic, hyperinsulinemic clamped glucose infusion r

25、ate with the relative change in PPAR phosphorylation for each patient。如图5e所示，在PPAR磷酸化变化与葡萄糖灌注速率之间呈一个强力的，负相关(r=0.92 and p=0.001)。因此，在这类病人中，使用罗格列酮对胰岛素敏感性的改善与Cdk5位点的PPAR磷酸化紧密相关。讨论现在呈现的数据为我们提出了理解肥胖症中脂肪细胞功能紊乱以及通过PPAR进行糖尿病治疗两者之间关系的基本框架（图16补充）。高脂饮食可以在体内激活蛋白激酶Cdk5。Cdk5介导的PPAR第273位丝氨酸磷酸化，使基因亚单位的表达失调，这些包括了许多重

26、要的新陈代谢调控因子，如脂肪酶，肥胖症中表达改变的首要的肥胖细胞选择性基因，以及脂联素，这是体内胰岛素抵抗的主要调控因子。第273位丝氨酸磷酸化并不会改变PPAR的染色体占位，这就提示有其他机制，如另外的共调节因子的代偿途径，可能导致靶基因的这些表达差异。抗糖尿病PPAR配体抑制第273位丝氨酸磷酸化，并减少在基因表达上的相关改变。重要的是，配体的这种对Cdk5介导PPAR磷酸化的抑制作用，改变了PPAR的形态和动态平衡，如第273位丝氨酸不在被这种蛋白激酶所修饰。实际上，只有极低活性的PPAR配体，如MRL24，对PPAR的作用和完全激动剂（罗格列酮）一样，甚至更好。考虑到两者均有强力的抗糖

27、尿病活性，则PPA R配体的大部分治疗效应很可能都是通过抑制Cdk5介导的磷酸化。图5d和e给出的研究数据也显示这种特异的磷酸化与罗格列酮在人体内的治疗效应紧密相关。值得注意的是，在动物实验中，治疗剂量的药物并不能完全抑制PPAR的Cdk5磷酸化，所以，采用更精确的靶配体可能可以获得更好的治疗效应。在这些结论的基础上，PPAR配体药物的激动活性在其作用中的地位仍不清楚。可能，小程度的的激动活性即可极大地加强阻断Cdk5介导的PPAR磷酸化的有效性。另一方面，这些药物的某些有争议的副作用，如体重增加，液体滞留，可能与这种经典的激动活性有关。这样可以更好地评估各种配体在临床前模型和人类受试者评估中

28、的激动作用的程度。更广泛的讲，部分激动剂影响蛋白磷酸化的能力可能对其他核受体家族的成员也有效，为发现新的药物提供了可能。 Cdk5在肥胖小鼠的脂肪组织中是怎样被激活的？在肥胖的大多情况下，脂肪组织中的细胞因子和脂肪酸增多，并且在试验中，这两者都有利于Cdk5的激活。Cdk5的刺激物以及细胞因子一般都是通过使Cdk5辅因子P35裂解为更稳定的P25亚基起作用。当由高脂饮食引起的作用于脂肪细胞的细胞外刺激不存在的，从图6补充中可以清楚地看出Cdk5的激活与P25的形成是同时地。高脂肪饮食和肥胖是否也导致非脂肪组织中的Cdk5激活是一个非常重要的问题，因为肥胖的负面影响可以从代谢综合征延伸到癌症以及

29、神经退行性疾病。神经退行性疾病与中枢神经系统中Cdk5的异常激活有关，需要进一步的研究以确定肥胖症时脑或其他组织中Cdk5是否被激活。方法概要细胞培养 在杜尔贝科改良的伊戈尔培养基中用10%的胎牛血清培养PPAR-空白小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。将FLAG-PPAR以及FLAG-PPAR S273A亚克隆到pMSCV-puro逆转录病毒载体中（Stratagene）。随着逆转录病毒感染细胞，用2 g/ml嘌呤霉素孵化使细胞选择性表达特定蛋白。用1 M的地塞米松，0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤以及850 nM胰岛素对细胞进行48小时干预，诱导3T3-L1（前脂肪细胞）或 MEFs的脂肪细胞分化

30、，随后将细胞转移到850 nM胰岛素维持量的培养介质中。体外酶分析 免疫纯化的WT或S273A突变型PPAR,在含有ATP的激酶缓冲液中用活性Cdk激酶进行3015min的孵育。阳性对照，我们使用了纯化组蛋白(Millipore)或Rb(Cell Signaling Technology)。一些PPAR配体在进行实验分析之前在培养液中进行30min的预孵化。基因表达分析 用Trizol试剂(Invitrogen)将全部RNA从细胞和组织中分离。使用ABI逆转录工具对RNA进行逆转录。利用ABI9300PCR仪，用SYBR绿色荧光染料染色，进行定量PCR实验。利用tata-结合蛋白以及采用-Ct

31、法测定相应的mRNA表达。实验动物 所有动物实验均根据Beth Israel Deaconess 医学中心的动物关怀和使用委员会相关规定，得以批准的条件下进行。从Jackson实验室购进45周大的C57BL/6J雄性小鼠。用标准饮食（10%千卡脂肪含量，D12450B，Research Diets Inc）或高脂饮食（60%千卡脂肪含量，D12492，ResearchDiets Inc.）饲养小鼠，如文中所述。在葡萄糖耐受实验中，对小鼠以10 mg/kg罗格列酮或MRL24持续腹腔给药6天，并且腹腔注射2 g/kg的D -葡萄糖在隔夜禁食前。方 法细胞培养 3T3-L1 和 HEK-293细胞

32、从ATCC中获得。在杜尔贝科改良的伊戈尔培养基中用10%的胎牛血清培养PPAR-空白小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。将FLAG-PPAR以及FLAG-PPAR S273A亚克隆到pMSCV-puro逆转录病毒载体中（Stratagene）。逆转录病毒的生产使用了10g的逆转录病毒载体40转染Phoenix packaging细胞。在48小时后，收集上清液并且过滤。随着逆转录病毒感染细胞，用2 g/ml嘌呤霉素孵化使细胞选择性表达特定蛋白。用1 M的地塞米松，0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤以及850 nM胰岛素对细胞进行48小时干预，诱导3T3-L1（前脂肪细胞）或 MEFs的脂肪细胞分化，随后将

33、细胞转移到850 nM胰岛素维持量的培养介质中。用Oil Red O staining检测细胞中的脂质积聚。细胞培养基中的脂联素分泌量用ELISA (Millipore)进行分析。细胞培养基中的化合物除特殊标记的外均来自Sigma。DNA构建以及Cdk5的shRNA HA-WT CDK5, HA-KD CDK5 和 Myc-p35均来自Addgene。小鼠的PPAR 或 PPAR基因被亚克隆进入标记性质粒pcDNA3.1 (Invitrogen)。针对Cdk5的Lentivial shRNA 表达载体所使用的序列是5-CGGGAGATCTGTCTACTCAAA-3。对于慢性病毒的产生，使用10

34、 g慢性病毒载体转染HEK-293T细胞(ATCC)。在细胞用慢性病毒转染的过程中，细胞需要用2 g/ml嘌呤霉素孵育筛选。体外酶分析 活性cdk5/p35, cdk1/cdc2, cdk2/cyclin A, cdk2/cyclin E 或 cdk4/cyclin D1激酶是从Millipore 或 Cell Signaling Technology购买。体内的Cdk5测定是根据产品说明书 (Cell Signaling Technology).进行。简单地说，1 g的免疫纯化WT或S273A突变型PPAR,在含有20 M ATP的激酶缓冲液(25 mM pH 7.5的三（羟甲基）氨基甲烷盐

35、酸盐（Tris-HCl）, 5 mM -甘油磷酸酯, 2 mM二硫苏糖醇(DTT), 0.1 mM Na3VO4, 10 mM MgCl2)中用活性Cdk激酶进行3015min的孵育。阳性对照，我们使用了纯化组蛋白(Millipore)或Rb(Cell Signaling Technology)。一些PPAR配体在进行实验分析之前在培养液中进行30min的预孵化。SDS - PAGE后的底物的磷酸化分析使用抗CDK底物抗体检测的K / R-S-P-K /R基序，这是CDK底物蛋白的共识基序(Cell Signaling Technology)。细胞或组织的溶解，免疫沉淀以及免疫印迹制备 表达C

36、dk5和PPAR的HEK-293细胞在转染后收集。全部的细胞溶解物在FLAG M2琼脂(Sigma)中4时孵育。用抗-Cdk基底，FLAG 或 HA (Roche)抗体对免疫沉淀或全细胞溶解物进行分析。在注明的特定时间，用TNF- (50 ng/ml), IL-6 (50 ng/ml), IL-1 (50 ng/ml) 或 FFAs(400 M 软脂酸和油酸混合物)干预分化型3T3-L1脂肪细胞，并且将细胞溶解产物用磷酸特异性或PPAR抗体进行分析。3T3-L1脂肪细胞事先用各种PPAR配体进行干预并且用TNF-进行孵育。对于组织溶解产物，将从小鼠身上得到的白色脂肪组织（WAT）在裂解液中RI

37、PA buffer（50 mM Tris 三羟甲基氨基甲烷pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 脱氧胆酸钠sodium deoxycholate, 0.1% 含蛋白酶以及磷酸酶抑制剂的SDS十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠）。For western blotting, a rabbit polyclonal phospho-specific antibody against PPAR Ser273 was produced by New England Peptides with a synthetic phosphopeptide corresponding to

38、 residues surrounding Ser273 of PPAR(Ac-KTTDKpSPFVIYDC-amide)。全部的组织溶解物用抗-PPAR，磷酸化-Cdk5（Y15），CDk5以及P35抗体(Santa Cruz).进行分析。基因分析 HEK-293细胞用pDR-1荧光素酶报告质粒转染HEK - 293细胞，PPAR，RXRa 以及pRL-renillin 用脂质体2000搭载(Invitrogen)。经过一夜的转染，再用罗格列酮和MRL24干预24小时。细胞的收集和报告基因的分析使用了双荧光素酶试剂盒(Promega)。荧光素酶活性被规范化到renillia activity

39、。基因表达分析 用Trizol试剂(Invitrogen)将全部RNA从细胞或组织中分离。使用ABI逆转录工具对RNA进行逆转录。利用ABI9300PCR仪，用SYBR绿色荧光染料染色，进行定量PCR实验。利用tata-结合蛋白（TBP）以及采用-Ct法测定相应的mRNA表达。此次研究使用的引物序列在表4补充中列出。裸鼠体内的脂肪垫生成 将稳定表达WT 或 S273A突变型PPAR的PPAR-空白成纤维细胞(1 × 107)按先前的方法植入78周大的雄性NCR裸鼠(Taconic)的皮下(n=5每一组)。在植入6周后，分离脂肪垫用于基因表达分析。基因芯片分析 从表达WT 或 S273

40、A突变型PPAR的PPAR-空白成纤维细胞或者用1M罗格列酮或MRL24干预24小时的WT细胞中分离全部的RNA。利用达纳 - 法伯癌症研究所基因芯片的核心设施按照既定的方法使用Affymetrix基因芯片小鼠基因组430 2.0阵列进行阵列杂交和扫描。这些阵列数据使用DNA-芯片(dChip)分析软件进行分析。基因表达的显著性差异用单边T实验来进行评估(p<0.05)。用卡方检练对全体基因的重复性进行统计学评估。为了确定调控Cdk5磷酸化PPAR的精确位点，我们首先计算了WT型相对于S273A突变型细胞在基因表达的折叠改变以及P值，并且我们绘制了log p相对于log2折叠改变值图。从基因序列中，我们选取数量改变大(1.4 fold difference)以及有显著性差异(p<0.05)的53位基因进行研究。使用qPCR技术在细胞和移植脂肪垫中对所选基因进行确认，结果产生的基因，包含了7个基因，用qPCR技术在小鼠白色脂肪组织中分析得到。实验动物 所有动物实验