化学发光免疫分析技术

1、化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术第一页，共46页。第一节第一节 慨慨 述述一、化学发光一、化学发光二、化学发光效率二、化学发光效率第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术一、化学发光剂一、化学发光剂二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术第二页，共46页。第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用四、临床应用考虑题考虑题小结小结第三页，共46页。发光免疫分析发光免疫分析: :是将发光分析和免疫反响相结合而建立起

2、来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。是将发光分析和免疫反响相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。 第四页，共46页。第一节第一节 概概 述述第五页，共46页。放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术第六页，共46页。 发光发光: :是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态较低能级跃迁到激发态较高能级，然后再返回到基态，并释放光子的过程。是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态较低能级跃迁到激发态较高能级，然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激

3、发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光、生物发光、化学发光等。 第七页，共46页。 光照发光光照发光photoluminescencephotoluminescence是指发光剂荧光是指发光剂荧光素经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激素经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光荧光。荧光。 生物发光bioluminescence是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反响底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在

4、回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。第八页，共46页。 化学发光chemiluminescence是指伴随化学反响过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反响时，吸收了反响过程中所产生的化学能，使反响的产物分子或反响的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一、化学发光第九页，共46页。 一些化学反响能释放足够一些化学反响能释放足够的能量把参加反响的物质激的能量把参加反响的物质激发到能发射光的电子激发态，发到能发射光的电子激发态，假设被激发的是一个反响产物假设被激发的是一个反响产物分子，那么这种反

5、响过程叫直分子，那么这种反响过程叫直接化学发光。反响过程可简单地描绘如下：接化学发光。反响过程可简单地描绘如下： A十十B C* C* C h其中其中为光子，为光子，C*表示表示C处于单线激发态。处于单线激发态。 第十页，共46页。假设激发能传递到另一个未参加化学反响假设激发能传递到另一个未参加化学反响的分子的分子D D上，使上，使D D分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，D D分子从激发态回到基态时发光，这种过分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反响过程可表示如下：程叫间接化学发光。反响过程可表示如下： A A十十B CB C* * C C* *十十D CD C十十D

6、 D* * D D* * D D十十hh第十一页，共46页。 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率CE和激发态分子的发射效率EM。化学发光反响的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反响都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率第十二页，共46页。第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术第十三页，共46页。 在化学发光反响中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。 一、化学发光剂一、化学发光剂第十四页，共46页。能作为化学发光剂的条件：能作为化学发光

7、剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；它的物理它的物理- -化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反响的结果；其化学发光常是氧化反响的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。第十五页，共46页。 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反响，它们在化学构造上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反响

8、，它们在化学构造上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。抗体。 第十六页，共46页。 1. 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H2O2氧化时氧化时,发发出波长为出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，的光，具有很高的发光效率，其激发态产物其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反响体甲基吖啶酮是该发光反响体系的发光体。系的发光体。 第十七页，共46页。2 2三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)32+ RU(bpy)32+是电化是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺学发光剂，它和电子供体三丙胺TPATPA在阳电极外在阳电极外表可同时失去一个电子而发生氧化反响。表可同

9、时失去一个电子而发生氧化反响。 三联吡啶钌三联吡啶钌第十八页，共46页。电化学发光剂反响原理电化学发光剂反响原理 第十九页，共46页。 酶促反响发光剂：酶促反响发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂底是利用标记酶的催化作用，使发光剂底 物发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反响发光剂。称为酶促反响发光剂。 1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2AMPPD第二十页，共46页。1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理第二十一页，共46页。鲁米诺增强发光反响原理鲁米诺增强发光反响原理 第二十二页，共46页。2AMPPD3-(2-3-(2-螺旋金刚

10、烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷第二十三页，共46页。1. 1. 碳二亚胺碳二亚胺EDCEDC缩合法缩合法 二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术第二十四页，共46页。2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 第二十五页，共46页。3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 第二十六页，共46页。4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 第二十七页，共46页。 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比

11、原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素第二十八页，共46页。第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 第二十九页，共46页。 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相，与待测标本中相应的抗原应的抗原(抗体抗体)发生免疫反响后，形成固相包被抗发生免疫反响后，形成固相包被抗体体-待测抗原待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需参吖啶酯标记抗体复合物，这时只需参加氧化剂加氧化剂H2O2和和NaOH使成碱性环境，吖啶酯使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光在不需要催化剂的情况下分解

12、、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析第三十页，共46页。发光发光YYY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标记物抗标记物抗体体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后1 1参加参加H2O2H2O2pH10pH10pH10直接化学发光的机理直接化学发光的机理第三十一页，共46页。磁微粒形式图磁微粒形式图Y

13、YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点抗原和抗体结合与未结合部分的抗原和抗体结合与未结合部分的易别离易别离磁微粒技术磁微粒技术第三十二页，共46页。 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析chemiluminescence enzyme chemiluminescence enzyme immunoassayimmunoassay，CLEIACLEIA是用参与催化某一化学发光反响的酶如辣是用参与催化某一化学发光反响的酶如辣

14、根过氧化物酶根过氧化物酶HRPHRP或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗体，在来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原与待测标本中相应的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反响后，形成固相包被发生免疫反响后，形成固相包被抗体抗体- -待测抗原待测抗原- -酶标记抗体复合物，经洗涤后，参加底物酶标记抗体复合物，经洗涤后，参加底物( (发光发光剂剂) )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统

15、，计算出测定物的浓度。数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析第三十三页，共46页。该分析系统采用辣根过氧化物酶该分析系统采用辣根过氧化物酶HRP标记抗标记抗体体(或抗原或抗原)，在与反响体系中的待测标本和固相载，在与反响体系中的待测标本和固相载体发生免疫反响后，形成固相包被抗体体发生免疫反响后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶HRP标记抗体复合物，这时参加鲁米诺发标记抗体复合物，这时参加鲁米诺发光剂、光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。和化学发光增强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫

16、分析第三十四页，共46页。辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 第三十五页，共46页。该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与，在与反响体系中的待测标本和固相载体发生免疫反响后，反响体系中的待测标本和固相载体发生免疫反响后，形成固相包被抗体形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物，酶标记抗体复合物，这时参加这时参加AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱脱去磷酸根基团而发光。去磷酸根基团而发光。 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析第三十六页，共

17、46页。碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 第三十七页，共46页。分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反应物使反应物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质加入加入底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测第三十八页，共46页。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析electrochemiluminescence electrochemiluminescence immunoassayimmunoassay， ECLIA ECLIA是以电化学发光剂三联吡啶钌标记是以电化学发光剂三联吡啶钌

18、标记 抗体抗体( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反响，它包括电化学和化学发光两个过程。反响，它包括电化学和化学发光两个过程。 三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析第三十九页，共46页。在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体抗体( (抗原抗原) )，用三联吡啶钌标记抗体，用三联吡啶钌标记抗体( (抗原抗原) )，在反响体系，在反响体系内待测标本与相应的抗原内待测标本与相应的抗原 ( (抗体抗体)

19、 )发生免疫反响后，形成磁发生免疫反响后，形成磁性微粒包被抗体性微粒包被抗体- -待测抗原待测抗原- -三联吡啶钌标记抗体复合物，三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPATPA缓冲液。当磁缓冲液。当磁性微粒流经电极外表时，被安装在电极下面的电磁铁吸引性微粒流经电极外表时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反响，使三联吡啶钌和电极加压，启动电化学发光反响，使三联吡啶钌和TPATPA在电在电极外表进展电子转移，产生电化

20、学发光，光的强度与待测极外表进展电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。抗原的浓度成正比。第四十页，共46页。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图第四十一页，共46页。电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图第四十二页，共46页。标记磁颗粒在电场中发光工作示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图第四十三页，共46页。 2 2生殖激素生殖激素 3 3垂体激素和皮质激素垂体激素和皮质激素 4 4贫血因子贫血因子 5 5肿瘤标志物肿瘤标志物 6 6感染性疾病感染性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、血清胰岛素、血清C-C-肽、血浆胰高糖素等。肽、血浆胰高糖素等。 8 8心脏标志物心脏标志物 9 9病毒标记物病毒标记物 10 10过敏性疾病过敏性疾病 11 11治疗药物监测治疗药物监测 四、临床应用四、临床应用第四十四页，共46页。1 1什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？2 2化学发光与荧光的区别？化学发光反响的条件？化学发光与荧光的区别？化学发光反响的条