HPLC检测食品中的四种磺胺类兽药

1、高效液相色谱法检测四种磺胺类高效液相色谱法检测四种磺胺类兽药残留兽药残留磺胺类药物磺胺类药物 主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象，在所有兽药药物在动物性食品中的残留超标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后，药物可不断在体内蓄积物性食品后，药物可不断在体内蓄积。磺胺类药物的毒性作用磺胺类药物的毒性作用p损害泌尿系统损害泌尿系统 磺胺类药主要经肾脏排出，在尿

2、中浓度较高，其溶解度又较低，尤其当磺胺类药主要经肾脏排出，在尿中浓度较高，其溶解度又较低，尤其当尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀胱内析出结晶，产生刺激和阻塞，尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀胱内析出结晶，产生刺激和阻塞，造成泌尿系统损伤，引起结晶尿、血尿、管型尿。造成泌尿系统损伤，引起结晶尿、血尿、管型尿。 p引起过敏反应引起过敏反应 p抑制造血系统抑制造血系统 p导致细菌产生抗药性导致细菌产生抗药性磺胺类药物结构磺胺类药物结构 磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺的衍生物，磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺的衍生物， 具有芳具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物氨基和磺酰

3、胺基，多为两性化合物 。 常用的磺胺类药物的化学结构式：常用的磺胺类药物的化学结构式： H2NSOONHRsulfonamide backboneRRR14Hsulfanilamide (SAN)NSsulfathiazole (STZ)NOsulfisozole (SIZ)NOH3CCH3sulfisoxazole(SIX)sulfamethoxazole (SMX)NOCH3NOCH3CH3Sulfatroxazole (STX)NNsulfadiazine (SDZ)NNsulfamerazine (SMR)CH3NNCH3CH3sulfamethazine (SMZ)or sulfad

4、imidine (SDD)NNOCH3sulfamethoxypyridazine (SPMX)NNOCH3sulfameter (SME)NNOCH3sulfamonomethoxine (SMMX)NNH3COOCH3sulfadoxine (SD)Nsulfapyridine (SP)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)磺胺类药物的分子结构磺胺类药物的分子结构 p磺胺类药物在兽医临床上的应用磺胺类药物在兽医临床上的应用 磺胺药对大多数革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用，在食源性动物磺胺药对大多数

5、革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用，在食源性动物的饲养中，磺胺类药物不仅作为兽药被广泛用于兽医临床对细菌感染的饲养中，磺胺类药物不仅作为兽药被广泛用于兽医临床对细菌感染性疾病的防治，有时也被用作饲料添加剂。性疾病的防治，有时也被用作饲料添加剂。p磺胺药的药代动力学磺胺药的药代动力学 磺胺药主要在肝脏中代谢，常见的方式是在对位氨基处发生乙酰化，磺胺药主要在肝脏中代谢，常见的方式是在对位氨基处发生乙酰化，其次是羟基化作用。有的磺胺药其乙酰代谢物的水溶性低，易在肾小其次是羟基化作用。有的磺胺药其乙酰代谢物的水溶性低，易在肾小管内析出结晶，而有些代谢物虽水溶性较高，但在酸性尿中也容易结管内析出结晶，而有

6、些代谢物虽水溶性较高，但在酸性尿中也容易结晶析出，容易引起结晶尿和肾并发症。晶析出，容易引起结晶尿和肾并发症。磺胺类药物对食品的污染磺胺类药物对食品的污染p使用过磺胺类药物的动物，如果不遵守适当的休药期，其肌肉组织、蛋使用过磺胺类药物的动物，如果不遵守适当的休药期，其肌肉组织、蛋和奶中就会被残留的磺胺类药物污染；短期大剂量或长期小剂量给药，和奶中就会被残留的磺胺类药物污染；短期大剂量或长期小剂量给药，很容易造成磺胺类药物在动物各组织中蓄积；很容易造成磺胺类药物在动物各组织中蓄积；p当饲料或饮水被磺胺类药物污染后，也可导致动物性食品中磺胺类药物当饲料或饮水被磺胺类药物污染后，也可导致动物性食品中

7、磺胺类药物残留量严重超标；残留量严重超标；p很多研究表明猪肉及其制品中磺胺药物超标现象时有发生，特别是致癌很多研究表明猪肉及其制品中磺胺药物超标现象时有发生，特别是致癌性的磺胺二甲基嘧啶残留给人类的健康带来了威胁。性的磺胺二甲基嘧啶残留给人类的健康带来了威胁。食品中磺胺类药物的最高残留限量食品中磺胺类药物的最高残留限量p英、美等国家对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为英、美等国家对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100 gkg-1；p欧盟第欧盟第675/92675/92号令中规定了，在肉类及牛奶中磺胺的最大残留总量不得号令中规定了，在肉类及牛奶中磺胺的最大残留总量不得超过超过

8、100 gkg-1；p日本要求的最高残留限量更严格，单个磺胺残留限量为日本要求的最高残留限量更严格，单个磺胺残留限量为20 g20 gkgkg-1 -1 ，最大残留总量不得超过最大残留总量不得超过100 gkg-1；p我国对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为我国对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100 gkg-1。提取和净化方法提取和净化方法 p磺胺类药物不易溶于非极性溶剂，而在极性较大的溶磺胺类药物不易溶于非极性溶剂，而在极性较大的溶剂中溶解性较好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、剂中溶解性较好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。丙酮、或乙酸乙酯提取。p净化

9、方法主要有柱色谱，净化方法主要有柱色谱，TLCTLC，液液萃取（，液液萃取（LLELLE），固），固相萃取（相萃取（SPESPE）和基质固相分散萃取（）和基质固相分散萃取（MSPDMSPD）等。）等。 磺胺类药物的磺胺类药物的HPLC法色谱条件法色谱条件p常采用反相硅胶柱对待测物进行分离，主要有常采用反相硅胶柱对待测物进行分离，主要有C18C18，C8C8或者或者C4C4柱，柱，有时也采用离子对色谱柱。有时也采用离子对色谱柱。p流动相主要由乙睛流动相主要由乙睛- -水，甲醇水，甲醇- -水或者乙睛水或者乙睛- -甲醇甲醇- -水按不同比例组水按不同比例组成，也有文献报道采用乙醇成，也有文献报道

10、采用乙醇- -水系统。在以上流动相系统中加入适水系统。在以上流动相系统中加入适量乙酸或者十二烷基磺酸钠（量乙酸或者十二烷基磺酸钠（SDSSDS）常用于提高分离效率。）常用于提高分离效率。目前常用磺胺类兽药的检测方法目前常用磺胺类兽药的检测方法1.分光光度法2.气相色谱法3.高效液相色谱法4.酶联免疫吸附分析法 5.高效液相色谱与质谱联用分析法实验目的实验目的了解检测磺胺类兽药残留的方法，掌握高效液相了解检测磺胺类兽药残留的方法，掌握高效液相色谱法检测磺胺类兽药残留的方法；色谱法检测磺胺类兽药残留的方法；了解高效液相色谱法测定兽药多残留的方法；了解高效液相色谱法测定兽药多残留的方法；了解建立高效

11、液相色谱法测定兽药多残留的方法了解建立高效液相色谱法测定兽药多残留的方法步骤及需要测定的参数。步骤及需要测定的参数。p磺胺类药物在紫外区（波长一般在250-280 nm）有吸收，可以选择高效液相色谱（配紫外检测器）对上述化合物进行分离，定性定量测定。 实验原理实验原理p 仪器：仪器：n岛津高效液相色谱分析仪岛津高效液相色谱分析仪 配有配有UV100UV100紫外检测器紫外检测器n隔膜真空抽滤器（津腾）隔膜真空抽滤器（津腾） n超声波清洗器超声波清洗器 n电子天平电子天平 nSHB- SHB- 循环水式多用真空泵循环水式多用真空泵 nGDYQ-701S GDYQ-701S 样品提取仪样品提取仪

12、n101-3101-3型型 电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱 nPHS-25 PHPHS-25 PH计计 仪器与试剂仪器与试剂磺胺噻唑 纯度99.9磺胺嘧啶 纯度99.9磺胺甲基嘧啶 纯度99.9磺胺二甲嘧啶 纯度99.9色谱纯甲醇仪器与试剂仪器与试剂溶液配制溶液配制 p标准样品溶液配制n准确称取四种SAs药物标准品10 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置成1 mg/ml的标准储备液。p 混合标准溶液n准确称取四种SAs的标准品10mg，共同置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成400 mg/L的标准储备液。 p色谱柱色谱柱 ：Symmetry Cl8反相色谱柱(46250

13、mm i.d)p检测波长检测波长：270 nm；p流动相流动相：甲醇：甲醇：1%（）乙酸 = 25：75p进样量：进样量：20 ulp流动相流速流动相流速: : 1 ml/min色谱条件色谱条件标准曲线的绘制 p由四种样品混合标准液400 ppm,进行等度稀释成质量浓度为8 ppm、6 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.4 ppm的标准系列，各取20 ul由高效液相色谱仪进样分析，据峰面积与相应质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。定性实验定性实验 p将标准样品的四种单品及混合样品溶液分别进行稀释至8 ppm，并经HPLC进样分析，根据四种单品各自出峰时间及混合样品中四种单样的出峰

14、时间比较进行定性 Minutes6810121416182022242628303234Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225(SDZ)(STZ) SMR SMO SMTSDMD SMP SCP SDXSIA 水样经过水样经过0.45um 膜过滤后直接进样膜过滤后直接进样浓度计算浓度计算样品的测定样品的测定mABYC其中：C样品中磺胺类兽药的含量，mg L-1； A

15、标准曲线的斜率Y 测定样品的峰面积；B标准曲线的截距；m 称取样品的量，L。液相色谱柱的使用和维护注意事项 样品的前处理样品的前处理最好使用流动相溶解样品。使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时，阀的转动不能过缓。柱的使用和维护注意事项应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应从有机溶剂直接改变为水，反之亦然一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲

16、时，才可以反冲除去柱头的杂质，否则反冲会迅速降低柱效 柱的使用和维护注意事项选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏有时可以连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶解避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱保护柱一般是填有固定相的短柱保护柱可以而且应该经常更换柱的使用和维护注意事项经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，常规分析需要50-75L。柱的使用和维护注意事项p正相硅胶柱以正已烷（或庚烷），二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。p反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺