细胞工程培养细胞的生长增殖过程

1、培养细胞的生长增殖过程培养细胞的生长增殖过程第四节第四节一体外培养细胞的生长增殖过程一体外培养细胞的生长增殖过程原代原代培养期培养期: :从体内取出组织从体内取出组织接种培养到第接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续一次传代培养这个阶段，一般持续1-41-4周。周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。不旺盛。传代期传代期：从原代培养的细胞的一经传代后从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-5010-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期：衰退期：细胞

2、增殖缓慢或不增殖。细胞轮细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。廓增强，最后衰退凋亡。1.1.原代培养原代培养（Primary Culture）期期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成

3、单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 2 2传代期传代期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代

4、1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 初代培养初代培养 细胞系细胞系 （连续细胞系）（连续细胞系）老化传代期0 2 4 6 8 10 12 14 周16 14 12 10 8 63衰退期：衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增

5、殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。二培养法二培养法培养瓶培养法培养瓶培养法培养板培养法培养板培养法 A A 培养瓶培养法培养瓶培养法 所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。 早期的培养

6、瓶是玻璃培养瓶，目前主要用早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。 与此相关的一种方法是盖玻片与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养，培养瓶培养，就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行细胞接种于盖玻片上，然

7、后放进培养瓶中进行培养。这样具有以下几优点：。培养。这样具有以下几优点：。 (1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。物的影响。 (2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。作，以及永久保存。 （3）增加了培养瓶的培养面积。）增加了培养瓶的培养面积。B B 培养板培养法培养板培养法培养板培养法曾被称为微量培养法，是培养板培养法曾被称为微量培养法，是现代体外培养技术最为常用的方法之一。现代体外培养技术最为常用的方法之一。具体做法是将培养细胞接种在培养板的具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在孔内，然

8、后在C0C02 2培养箱内培养。最常用培养箱内培养。最常用的培养板有的培养板有6 6孔、孔、2424孔和孔和9696孔培养板，后孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。者最为常用。一般都是一次性使用。三三 原代培养技术原代培养技术幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。任何动物细胞培养均从原代培养开始。任何动物细胞培养均从原代培养开始。原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养原代培养原代培养包括：取材、分散细

9、胞、接种、培养包括：取材、分散细胞、接种、培养等等在所有操作中，多都要注意保持培养物在所有操作中，多都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件。及生长环境的无菌条件。组织块培养组织块培养组织块的原代培养方法，首先从机体某组织块的原代培养方法，首先从机体某部位取下组织，方法：部位取下组织，方法： 处死动物处死动物 将组织块剪碎将组织块剪碎 Hanks液液 冲下剪刀上的碎块，补加冲下剪刀上的碎块，补加35mLHanks液液 吹打、低速离心、吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块弃上清液、留下组织块 吸管取吸管取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁上，（有组织块的瓶壁朝上）

10、加入培养上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养液液 培养培养 传代传代组织块也可用两只手术刀片将组织块切组织块也可用两只手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。长，容易污染。对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。组织消化培养组织消化培养1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间质较少的软组织。质较

11、少的软组织。2、培养过程：、培养过程：处死动物处死动物 - 将组织块剪碎将组织块剪碎 Hanks液液 冲下冲下剪刀上的碎块，补加剪刀上的碎块，补加35mLHanks液液 吹打、低吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块速离心、弃上清液、留下组织块 :组织消化组织消化-吸管吸管取出组织液放入培养瓶内，加入培养液取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 - 培养培养- - 传代传代接种接种 加入培养基加入培养基 培养（每次换液后更换新的瓶塞培养（每次换液后更换新的瓶塞 ）根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有3 3种：种：1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法

12、传代：离心（10001000转转/ /分分）去上清，）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除上清培养液去除l l2 2一一2 23 3，然后用吸管直，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。接吹打形成细胞悬液再传代。传代培养传代培养2 2半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶消化法传代。常用的消

13、化液有消化法传代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。3 3贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。1.首先将超净工作台用紫外首先将超净工作台用紫外光灯照射灭菌光灯照射灭菌20-30分钟；分钟；贴壁细胞传代贴壁细胞传代-消化过程消化过程2. 关闭超净工作台内的紫外光灯关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精点燃酒精灯灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行一切操作均需在酒精灯火焰下进行)3.将消毒过的所用物品放入超将消毒过的所用物品放入超净工作台

14、中；净工作台中； 4.将培养好的将培养好的HeLa细胞培养细胞培养皿放入超净工作台中皿放入超净工作台中； 5.用无菌吸管将细胞上原有的用无菌吸管将细胞上原有的培养液吸净培养液吸净，弃去培养液。6. 分别取分别取1毫升毫升0.25%胰酶消化液放胰酶消化液放入培养皿中入培养皿中7.将加有胰酶消化液的培养皿将加有胰酶消化液的培养皿放入放入37温箱中消化温箱中消化1分钟分钟 8.从温箱中取出培养皿后从温箱中取出培养皿后用手轻轻拍打培养皿的边缘；用手轻轻拍打培养皿的边缘； 9.用倒置式显微镜观察细胞用倒置式显微镜观察细胞是否完全脱落是否完全脱落细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从

15、细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应止反应如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：检查细胞形态及活力：检查细胞形态及活力：状态良好的细胞状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细应是轮廓不十分清晰，而生长

16、不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。检查营养液检查营养液PH及污染：及污染：新鲜的呈桃红色，新鲜的呈桃红色，PH在在7.2-7.4之间。之间。培养一段时间后，培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。下降，培养液变黄。培养箱可自动控制培养箱可自动控制5% 的含的含量。量。细胞计数细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数程序程序

17、用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧， 以便滴加细胞悬液以便滴加细胞悬液. 取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。 从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。 注意：注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。勿使液体漫过盖片或出现气泡。 镜下观察计数：镜下观察计数： 计算计数板四角大格计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算内的细胞数，压线者只计算 左侧和上方的左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。右侧和

18、下方的不计算在内。按下式计算：按下式计算：细胞数细胞数/毫升原液毫升原液= 注意：注意：镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占细胞团占10%以上以上,说明消化不充分；细胞数少于说明消化不充分；细胞数少于200个个/10平方毫米或多平方毫米或多于于500个个/10平方毫米平方毫米时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。再计算。细胞计数：细胞计数： 细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数量。一般以细胞数/毫

19、升表示。用品：细胞毫升表示。用品：细胞悬液悬液,培养液培养液,计数板。计数板。1 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。和计数板之间。3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。4 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：侧和上方的。然后按下式计算：细胞数细胞数/ /mlml4 4大格细胞总数大格细胞总数/ 4/ 410

20、00010000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占个细胞计算，若细胞团占10%10%以上，说明分散不好，需重新制以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。备细胞悬液。计数法计数法: 寻根问底寻根问底胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。制好胰蛋白酶

21、的消化时间。贴壁生长细胞传代小结小结加消化液得到加消化液得到分散的单细胞分散的单细胞 倒掉消化液倒掉消化液 加培养液终止消化加培养液终止消化 吹打成细胞悬液吹打成细胞悬液 接种接种2-4个培养瓶生长个培养瓶生长贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。大多数动物细胞在离体面进行的培养。大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体表面才能正常生长，荷的固体或半固体表面才能正常生长，最终在附着表面扩展成单层。最终在附着表面扩展成单层。贴壁培养的材料与系统贴壁培养的材料与系统贴壁培养的表面要求具有净阳

22、电荷和贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和高度的表面活性。如果是有机物表面，高度的表面活性。如果是有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。主要必须具有亲水性，并带阳电荷。主要材料有：材料有： 玻璃玻璃 、塑料、塑料、 金属、微载体。金属、微载体。 贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系统玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系统的核心是采用可以摇动或转动的圆筒培的核心是采用可以摇动或转动的圆筒培养容器，能使细胞交替接触培养液和空养容器，能使细胞交替接触培养液和空气。但是，该系统具有表面积有限、培气。但是，该系统具有表面积有限、培养条件检测受

23、到限制、劳动强度大、占养条件检测受到限制、劳动强度大、占用空间大等不足。用空间大等不足。凡凡维茨尔开发的微载体培养系统一定程维茨尔开发的微载体培养系统一定程度上克服了这些缺陷。度上克服了这些缺陷。 微载体培养动物细胞是一种适合大规微载体培养动物细胞是一种适合大规模生产动物细胞生物制品的一种非常有模生产动物细胞生物制品的一种非常有价值的培养技术价值的培养技术贴壁生长的细胞生长特性贴壁生长的细胞生长特性原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就可进入对数生长期。一般数天后就可铺满生长表面，形成

24、致密的细胞单铺满生长表面，形成致密的细胞单层。这种方法易于观察细胞生长状层。这种方法易于观察细胞生长状况，适宜于实验室研究。但是如需况，适宜于实验室研究。但是如需继续培养，需将单层细胞再分散，继续培养，需将单层细胞再分散，稀释后再重新接种，进行传代培养。稀释后再重新接种，进行传代培养。贴壁生长的细胞一般生长过程是：贴壁生长的细胞一般生长过程是： (1)游离期：游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期：吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、细胞类型不同

25、，贴壁时间有所差异。单个细胞、传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一般多数细胞都可在般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间内贴壁，平均贴壁时间大约大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、而细胞状态不好及濒死细胞、培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。不利于细胞贴壁。 (3)繁殖期：繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量过一段停滞，开始分裂。随着细

26、胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片，的增多，细胞间开始接触并连接成片，这时细胞的运动及分裂都会停止。这种这时细胞的运动及分裂都会停止。这种由于细胞间的接触而发生抑制的现象称由于细胞间的接触而发生抑制的现象称之为接触性抑制。之为接触性抑制。 (4)退化期：退化期：细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代，胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代，细胞会从瓶壁上脱下来。细胞会从瓶壁上脱下来。贴壁培养优点贴壁培

27、养优点(1)贴壁培养比较容易更换培养基。贴壁培养比较容易更换培养基。(2)容易采用灌注培养，从而达到提高细容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的。胞密度的目的。(3)更有效地表达同一产品。更有效地表达同一产品。(4)可以方便地调节培养液和细胞比例。可以方便地调节培养液和细胞比例。(5)易于观察细胞生长状况。易于观察细胞生长状况。 【思考题】【思考题】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题：问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。旁栏思考题旁栏思考题3.进行动物细