活性氧和活性氮的生成和处理

1、第九章活性氧和氮物种的合成与代谢朱小桢（译）最近的25年，在运动生理学中，活性氧和氮物种的作用已受到了相当大的重视。现已证明，重体力活动可通过多种机制诱导增强氮物种的产生。在这种背景下，氮物种的产生似乎影响到运动生理学研究中的重要机制。有证据表明，为应对剧烈的体力活动而形成活性氧和氮物种会导致氧化应激。然而，运动引起氧化应激的功能意义仍然是值得商榷的。最近的一些研究揭示了活性氧和氮物种作为信号分子的重要作用。在这种背景下，活性氧和氮物种调节一系列生理功能。活性氧和氮物种调节未疲劳和疲劳的骨骼肌收缩功能。活性氧和氮物种通过氧化还原敏感性转录因子调节基因表达是一个重要的调节机制，这被认为是参与训练

2、的适应过程。内源性抗氧化系统针对定期训练而产生的适应可能会导致运动诱导的氧化应激的限制，并反映出是增强运动耐受性的潜在机制。训练的效果似乎也包括活性氧和氮物种生成的改变，这可能在慢性疾病的治疗和预防过程中发挥有益作用。目前，许多关于运动对活性氧和氮物种相关机制在人类细胞水平上的影响的可用数据，来源于外周免疫活性细胞的研究。因此，免疫学方面的内容是本章的一个重要组成部分。本章的第一部分提供了有关活性氧和氮物种的基本知识，集中在他们的生成特性、作用机制、参与的生理功能、以及构成抗氧化系统。第二部分介绍了当前关于急性和慢性运动在形成、作用、调节活性氧和氮物种特性上的具体影响，以及抗氧化系统产生反应的

3、知识。生物体内的活性氧和氮物种根据定义，自由基是在其轨道中存在具有非常明显的化学活性的一个或多个不成对电子的原子或分子（哈里维尔1998）。通常，用一个点（.）来象征自由基物质。额外的氧化衍生物没有不成对的电子被归类为非自由基。这样的非自由基与自由基相比，也发挥氧化作用和具有相似的反应活性及调节作用（德勒格2002）,图9.1总结了活性氧和氮的主要类型，特别是对于其生成酶控制的，非酶促的，和铁或铜催化的机制已显示负责。化学反应性和产生的毒性靶细胞在不同类型活性氧和氮物种之间是不同的。迄今为止，活性最强的含氧物质是羟自由基（OH）（哈里维尔1998）。超氧阴离子（.O/）是生物相关的活性氧中最彻

4、底的研究。基础条件下，身体产生的总的.02已计算为接近2公斤/年（哈里维尔1998）。由亚硝酸盐和硝酸盐的定量测量，已证明一氧化氮（.N0）在大量生成，达到9公斤/年（哈里维尔1998）。活性氧和氮物种产牛的机制一个术语之间的区别是：以氧为中心的活性氧（ROS和氮衍生的活性氮（RNS,而术语活性氧和氮物种则统一了这两个种类。有几中机制被认为是负责合成活性氧和活性氮的。氧为中心的活性物种及其衍生物通过NADP用化酶亚基产生超氧阴离子是一个机制，具存在于吞噬细胞和多种其它细胞中，例如血管平滑肌细胞、内皮细胞、心脏和骨骼肌细胞以及成纤维细胞（Griendling等人，1994；Javesghani等

5、人，2002；Jones等人，1996）。由非吞噬细胞中的NADPHR化酶形成的活性氧程度较低，而在氧化还原敏感性信号传导途径的调节中起着重要的作用。NADPK化酶活化的心血管亚型，已被证明发生在代谢、血液动力学，和荷尔蒙的变化反应中（Droger2002）。血小板源性生长因子、凝血酶、和月中瘤坏死因子-a（TNF-a）刺激血管平滑肌细胞的NADP率化酶，而内皮细胞对机械力作出反应。最近，在大鼠的实验中显示，一个非线粒体NADP市化酶酶复合物存在于骨骼肌纤维内部。它具有类似于非吞噬细胞的NADPHR化酶的特性，并有助于骨骼肌基底活性氧的形成。（Javesghani等人2002超氧自由基（.。2

6、-）通过线粒体电子传递链氧化还原反应的半酿化合物连续地产生。在线粒体氧化磷酸化的过程中，分子氧发生四电子还原。这反一应是由细胞色素氧化酶催化的，并用于大约90%至98%的氧气消耗。其余的氧发生单价还原形成超氧阴离子.O2（哈利韦尔1998）,这一过程发生在所有含线粒体的细胞中，以及似乎随着年龄的增长而进一步增强（德赛等人1996）。在更深一层的步骤中，生成的超氧阴离子.O2-可以通过铁催化的反应转换成.OH。在文献中，关于线粒体中的总电子通量的估计显示出，通过电子漏并导致.O2-形成程度存在1%至5%之间（哈利韦尔1998）。因此，可以认为，线粒体电子传递链是量化活性氧形成的最重要的机制。黄喋

7、吟氧化酶主要位于血管内皮细胞，能催化次黄喋吟转化成黄喋吟，进而生成尿酸。黄喋吟氧化酶通常以脱氢酶的形式存在体内（XD黄喋吟脱氢酶），它利用烟酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD作为电子受体，形成极大量的活性氧（罗伊和麦科德1983）。通过激活钙依赖性蛋白酶琉基氧化或蛋白水解能导致黄喋吟脱氢酶转换成黄喋吟氧化酶，其中后者在催化作用中利分子氧形成超氧自由基（Parks和Granger1986）。这种活性氧的生成过程已经在代谢性应激下被研究,在细胞缺氧复氧损伤中起着特殊的作用（Granger1988）。止匕外，缺氧或局部缺血与磷酸腺甘（AMP的积累相关联，是由于受损三磷酸腺甘（ATP再合成的结果。磷酸腺甘（A

8、MP进一步转化为肌甘酸（IMP）,导致次黄喋吟的水平增加，这是黄喋吟氧化酶的主要底物。游离铁已被证明能催化活性氧的生成。_一个著名的的铁催化生成活性氧的机制是芬顿反应，其将过氧化氢（H2O2）转换成更多的羟基自由基（芬顿1894）。通过还原Fe3+为Fe2+,超氧阴离子.。2可以增加铁离子对芬顿反应的的有效性（哈利韦尔1998）。铜也有与形成反应生成OH的潜力（Haber和Weiss1943）。此外，电子转移到过氧化物和氢过氧化物可以通过铁和铜离子送达，并导致活性氧的生成。花生四烯酸作为前列腺素和白三烯途径的前体起着重要的作用。前列腺素通过环氧合酶形成，进而，前列腺素的生物合成伴随着活性氧的产

9、生。同样，通过脂氧合酶转换花生四烯酸为白三烯，已被确定为是活性氧的一个来源（Losetal.1995）。然而，在形成活性氧时的花生四烯酸代谢的潜在作用尚未明确。氮为中心的活性物质及其衍生物一氧化氮（NO是通过三种不同的一氧化氮合成酶（NOS将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸而来。一氧化氮合酶已被分为有神经型（nNOSENOS1、内皮型（eNOS或NOS3和诱导型（iNOS的或NOS2,其中后者主要是在免疫系统中。然而，许多组织中表达一个以上的这些亚型。虽然三种一氧化氮合酶亚型催化相同的反应，但他们的调节、优先表达部位、以及一氧化氮合成的量和持续时间上有所不同（表9.1）（Lincoln等人1997年

10、）。神经型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶表现出组成型表达，并且预成型蛋白获得活性时钙离子内流以及结合钙调蛋白。血管通过内皮型一氧化氮合酶形成一氧化氮，是直接通过增加血液流动和剪切力来促进的（Cooke等人，1991）。由于损伤或肌肉机械活动，神经型一氧化氮合酶蛋白表达增加，而神经损伤后它的表达会降低（斯塔姆勒和迈斯纳2001）0神经型一氧化氮合酶和内皮型一氧化氮合酶产生低水平的一氧化氮活化，不超过微微摩尔。相比之下，诱导型一氧化氮合酶的活性不依赖于细胞内钙离子，主要由信号转导通路转录水平进行调控，涉及核因子-kB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs、蛋白激酶C、和低氧诱导因子-1（HIF-1）（

11、波格丹2001;温格2000）。一旦表达，诱导型一氧化氮合酶生成一氧化氮的含量很高，这一过程可以持续几个小时甚至几天。免疫活性细胞在刺激过程中,中性粒细胞和巨噬细胞可以通过激活吞噬细胞亚型的NADPHC化酶产生大量的超氧化物及其活性衍生物（博格达等人，2000）。止匕外，NADPHC化酶也存在于嗜酸性粒细胞中，可以诱导活性氧的形成（Lindsay和Giembycz1997活性氧在免疫活性细胞中的形成是一系列酶控制和非酶促反应（图9.1）。在中性粒细胞中，氧分子起初通过NADPHK化酶还原成超氧阴离子.O2，在接下来的步骤中，通过超氧化物歧化酶发生超氧化物歧化产生的HQ。过氧化氢通过髓过氧化物酶

12、（MPO的催化进一步车$化为次氯酸（HOCI。次氯酸是最强的氧化杀菌剂，也是呼吸爆发的酶级联反应中的最终产物（Weiss1989）。刺激中性粒细胞和单核/巨噬细胞产生活性氧受复杂的调控机制的影响。脂多糖（LPS）和多种细胞因子或趋化因子是重要的活化剂和吞噬细胞NADPK化酶调节剂。白细胞介素8有着特殊的作用，因为它不仅能诱导形成活性氧，也有许多其它生物学特性，如对细胞迁移和粘附分子表达的诱导（Baggiolini等人1995）。证据表明，在中性粒细胞和单核细胞中，氧化爆裂的细胞内信号传导部分取决于游离钙离子（Cc2+）的增加。多种免疫活性细胞在炎性刺激下，如细胞因子和内毒素刺激，可引起诱导型一

13、氧化氮合酶的表达。缺氧、高温和低浓度.NO本身，是非炎症性诱导型一氧化氮合酶的诱导剂。与此相反，皮质醇和更高水平的.NO将发挥抑制作用。在这样的背景下，后者的机制似乎反映出是预防.NO过量生成的重要的反馈机制。需要重视的是，在某些条件下，一些非免疫细胞，例如肝细胞、上皮细胞、心脏和骨骼肌细胞也能够引起诱导型一氧化氮合酶表达（林肯等人1997;斯塔姆勒和迈斯纳2001）。活性氧和活性氮的作用机制大多数的活性氧和活性氮的直接化学作用被局限于它们产生的附近的位置，并且由它们的反应性和合适的反应伙伴的可利用性来确定。活性氧和氮物种的特性，产生一种强大的破坏作用，它是对脂质、蛋白质、核酸、以及细胞外基质

14、产生破坏性影响的基础（哈利韦尔1998）。另一方面，活性氧和氮的物种，如在严格控制的条件下可中等水平（适度）的生成，在各种信号传导过程中承担起调节介质的的作用（Droge2002）,并实现重要的生理功能。生物系统中的氧化应激二要维持细胞的氧化还原平衡,活性氧的生成率和抗氧化系统能力之间需要平衡。目前的范式提出了，细胞的氧化还原平衡主要是受氧化还原敏感的信号转导机制调节，通过诱导清除系统对增强活性氧的形成作出反应。然而，如果活性氧的产生过多或快速，系统可能无法充分反应。反过来，细胞的氧化还原状态转向更加促氧化状态，与增强脂质、蛋白质和核酸的氧化修饰作为一个结果（哈利韦尔1998）。脂质过氧化非酶

15、促脂质过氧化过程的初始步骤是通过氢从活性氧的多不饱和脂肪酸（PUFA侧链的提取来反映。反过来，产生脂质自由基和氧是在这个自由基链反应的中间和传播步骤所必需的。金属离子分解脂质过氧化物，增加可用的过氧化氢和烷氧自由基，从而提取氢和开始新的过氧化周期（哈利韦尔1998）。脂质过氧化过程中的脂质过氧化物的积累，对细胞膜会产生破坏影响。这种情况会干扰细胞的完整性，并进一步导致活性氧介导的反应。过氧自由基不仅能够从多不饱和脂肪酸中除去氢，也能从核酸和氨基酸中除去氢，说明脂质过氧化过程中DNAffi膜蛋白的氧化修饰的发生。蛋白质氧化活性氧的作用包括在氨基酸残基（如精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸

16、）中的各种氧化修饰（Stadtman2001）。蛋白质的氧化修饰的主要途径包括初始.OH-诱导提取氢从氨基酸残基形成碳中心自由基。进一步反应导致烷基、过氧化氢和烷氧自由基的形成，而这也可能从氨基酸残基中提取氢。氧化蛋白质损伤研究中最常用的标记是活性染基衍生物（RCD。修饰的蛋白质会影响其生理功能和加速蛋白水解降解，这可利用谷氨酰胺合成酶为例进行证明（莱文1983）。像甘油醛磷酸脱氢酶或线粒体ATP合成酶的抑制，是通过活性氧经琉基氧化而引起的，如过氧化氢（科克伦1992）。基于标记物如活性染基衍生物，氧化蛋白的积累已是公认的逐渐发生在老化的过程中，并且与一系列疾病的严重程度相关（Stadtman

17、2001）。有趣的是，氧化损伤的蛋白质发挥清除作用，这已被证明比那些观察DNAK化损伤DNAG被认为是氧化损伤最显著的生物标记。关于DNA®伤速率的估计表明,每个人体细胞平均每天至少发生几百个DNAK化损伤（Loft和Poulsen1999）。有进一步的报道，线粒体DNA（mtDNA氧化损伤的量比核DNA（nDNA有更高的稳定状态。核DNA（nDNA氧化损伤被认为是在癌症发展中的一个潜在的病理生理学因素。线粒体DNA勺氧化修饰会导致线粒体DN较变的积累，这反过来又导致线粒体呼吸功能的缺陷和干扰细胞的能量供应（约翰斯1995）。细胞通过复杂的DNAW复酶系统，能快速修复DNA勺损伤。（

18、克罗托和玻尔1997）。DNA勺氧化损伤包括DNA«基修饰、糖病变、单链或双链断裂、碱基位点和DNA蛋白质交联（图9.2）。鸟喋吟核昔的氧化是最丰富的DNAW饰之一，并导致8-羟基-2-脱氧鸟昔（8-OHdG的形成。由于其损伤的性质，8-羟基-2-脱氧鸟昔直接参与癌变的过程，在许多实验室已经将对8-羟基-2-脱氧鸟音的检测，作为DNAM化损伤检测的生物学标记（LOFT和Poulsen1999）。然而，活性氧的致癌作用也似乎是基于原癌基因的激活或抑癌基因的失活，通过以上长期形成的二次染色体断裂剂，称为致畸因素（Emerit1994）。活性氮物种的作用机制一一氧化氮快速扩散，并且由于其反

19、应活性高，有大量的靶细胞。,NO的毒性通过与超氧阴离子,02一反应而大大增强，这将产生高活性的过氧亚硝基阴离子（ONOQ-o过氧亚硝基阴离子0N00的加入会导致脂质、蛋白质和DNA的氧化与硝化，导致细胞死亡。止匕外，亚硝酸盐（N0）的形成可涉及,NQ2基团中间产物的生成，这反过来又可以诱导氨基酸残基（如酪氨酸）的硝化（Tirosh和Reznick2000）。这些在细胞分子或氧化还原金属蛋白中的.NO的影响（Stadtman2001）,为一系列的信号功能和细胞毒性作用提供依据（林肯等人1997）o此外，活性氧和一氧化氮的作用，特别是超氧阴离子,O2,反映了一个重要的“清道夫”的作用。有趣的是，一

20、氧化氮消除超氧阴离子的速度是超氧化物歧化酶（SOD的三倍。因此，同样的活性氧，活性氮的作用可以描述为一个“双刃剑”。性氧通过这些途径双向调节细胞的增殖与死亡当在受控条件下产生时，一氧化氮实现各种有用的功能。它在细胞信号传导通路中起着重要的作用，主要是通过鸟甘酸环化酶激活离子通道进行调节（Wink等人1993）。通过增加细胞内环磷酸鸟甘（cGMP的水平，一氧化氮引起血管舒张（详情，见第12章）。止匕外，在作为一种神经递质，抗凝或抗凋亡分子，或白细胞粘附到内皮细胞的抑制剂，并增强了骨骼肌细胞葡萄糖摄取（安加德1994;蒙卡达和希格斯1993;斯蒂法内利等人1999）。止匕外，一氧化氮参与宿主防御，

21、但也在组织发生炎症反应是产生（波格丹2001）。在能量代谢中，一氧化氮的复杂作用包括对线粒体呼吸链NAD制酶Q氧化还原酶、琥珀酸-辅酶Q氧化还原酶的抑制（Stuehr和Nathan1989）和糖酵解过程中甘油醛-3-磷酸-脱氢酶的抑制（莫尔等人1994）,这可能会导致细胞能量耗竭。活性氧和氮的物种和免疫系统通过活性氧和氮的物种及相关产物破坏入侵微生物、月中瘤细胞或退化的细胞，代表了先天性免疫的一个的重要机制（波格丹等人2000）。氧化爆裂在宿主防御中的重要性，最好的例证是慢性肉芽月中病，其中，在嗜中性粒细胞中，NADPH氧化酶缺乏伴随着活性氧生成的削弱或完全不形成。具结果是，受影响的个体出现严重的感染。吞噬细胞除了中性粒细胞、利用活性氧破坏微生物到什么程度还没有完全明确（波格丹等人2000）。巨噬细胞氧化爆裂的主要生理作用，已被认为是氧化还原信号而不是杀菌活性（forman和Torres2001）。要注意的是，活性氧与活性氮在免疫系统内的协同作用，其可增强宿主防御机制的能力。然而，相比于活性氧，人体免疫系统中的一氧化氮的确切作用尚不清楚。在啮齿类动物中，巨噬细胞杀死月中瘤细胞和微生物的能力，在某种程度上取决于通过诱导型一氧化