蛋白的分离纯化详解

1、一、蛋白质的分离纯化概述与蛋白质分离纯化相关的理化特性分子大小分子形状带电特性溶解特性与配体特异性结合不同吸附性质变性和复性n哪些技术、原理分子大小 重点大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。常用方法 透析 超滤 凝胶过滤 离心分子形状 重点形状：蛋白质在离心通过溶液、膜、凝胶颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。方法 密度梯度离心 电泳 分子筛层析（三格写，两格不写）电荷原理：蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。方法 电泳 离子交换层析溶解度原理：由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。方法：

2、 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法配体特异性结合 重点 原理：将具有亲和结合的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，来分离另一个分子。分类 免疫亲和层析 生物亲和层析 金属螯合亲和层析 拟生物亲和层析吸附性质原理：根据次级键相互作用。方法：吸附层析变性和复性原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。方法：尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白二、蛋白质的分离纯化细胞破碎细胞破碎蛋白溶解蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗粗 提提沉淀相分离分子筛精精 提提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶保保 存

3、存预处理（沉淀）原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限n纯化 预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换）机械方法：搅拌、振动研磨压滤超声匀浆非机械方法：干燥渗透压冻融酶体积离子强度 pH温度蛋白质的稳定蛋白质的粗分离 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀(重点)、透析、超过滤、蛋白质结晶等。蛋白质的纯化 粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状

4、况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。 常用的实验技术：层析（离子交换等）和电泳 常用蛋白质电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF） 双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）n双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 凝胶中蛋白的检测 图像采集和分析 蛋白鉴定 分离蛋白质组所有蛋白图像分析在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利

5、用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。原理（问度娘） Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

6、检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。膜种类硝酸纤维素NC膜PVDF膜尼龙膜膜的特点 转膜方法转膜方法 重点重点半干法半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 电转仪蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。两种常用检测酶系统的比较内参的选择 原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、半衰期短 荧光底物法： Krypton 荧光底物抗体的选择 单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少价格贵，所以一般来说多抗足够了。一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特