放射示踪及自显影

1、放射性核素标记化合物放射性核素标记化合物定义：定义：放射性核素标记化合物（放射性核素标记化合物（radionuclide labelled compound）指在化合物分子中引入可起示踪作用的放射性核指在化合物分子中引入可起示踪作用的放射性核素，并保持原有化合物的理化和生物学性质不变。素，并保持原有化合物的理化和生物学性质不变。 1、放射性浓度、放射性浓度(radioactive concentration)：指单位体积的溶液：指单位体积的溶液中所含有的放射性活度。以中所含有的放射性活度。以Bq/L或或Bq/ml等表示。等表示。 2、放射化学纯度、放射化学纯度(radiochemical pu

2、rity)：指所指定（规定化学：指所指定（规定化学形式）的放射性标记化合物的放射性活度占该样品的总放射性活形式）的放射性标记化合物的放射性活度占该样品的总放射性活度的百分比。要求放化纯度要达到度的百分比。要求放化纯度要达到95%以上。以上。 放化纯度放化纯度(%)=(标记物的放射性活度标记物的放射性活度)/(样品总的放射性活样品总的放射性活度度)100%。 4、放射性核素纯度：是指特定的放射性核素的放射性活度占总、放射性核素纯度：是指特定的放射性核素的放射性活度占总放射性活度的百分比。放射性活度的百分比。 放射性核纯度放射性核纯度(%)=(特定放射性核素的活度特定放射性核素的活度)/(样品的总

3、放射性样品的总放射性活度活度)100% 一般要求放射性核素纯度要达到一般要求放射性核素纯度要达到99%以上。以上。 5、化学纯度、化学纯度(chemical purity)：指某一化学形式存在的物质量：指某一化学形式存在的物质量在该样品的总重量中所占的百分比。在该样品的总重量中所占的百分比。同位素标记与非同位素标记同位素标记与非同位素标记 1、同位素标记、同位素标记(isotopic labeling)：指化合物中的某一稳定核素：指化合物中的某一稳定核素被其放射性同位素置换。比如用被其放射性同位素置换。比如用3H取代化合物分子中的取代化合物分子中的1H。 2、非同位素标记、非同位素标记(non

4、-isotopic labeling)：采用并非原化合物所：采用并非原化合物所含元素的放射性核素进行标记而称之。如蛋白质用含元素的放射性核素进行标记而称之。如蛋白质用131I或或125I标标记，所得标记物与原来化合物不完全相同。记，所得标记物与原来化合物不完全相同。定位标记与非定位标记定位标记与非定位标记 1、定位标记定位标记(specific labeling)：指标记原子标记在化合物的指：指标记原子标记在化合物的指定位置上，以符号定位置上，以符号“S”表示。例如表示。例如1(S)- 14C-醋酸，表示醋酸，表示14C标记在标记在醋酸羧基碳上，即醋酸羧基碳上，即CH3 14COOH。 2、非

5、定位标记非定位标记(non-specific labeling)：指标记原子可标记在化：指标记原子可标记在化合物分子的任意部位上。它又可分为均匀标记和全标记。合物分子的任意部位上。它又可分为均匀标记和全标记。 均匀均匀标记标记(uniform labeling)是指放射性原子均匀地分布于分子中，以是指放射性原子均匀地分布于分子中，以“U”表示。表示。全标记全标记(general labeling)是指放射性核素的原子随机地无严格定位是指放射性核素的原子随机地无严格定位地分布于被标记化合物分子结构上，以地分布于被标记化合物分子结构上，以“G”表示，又称普通标记。表示，又称普通标记。如氚标记化合物

6、，标记分子中的所有氢原子都可被取代，但机率如氚标记化合物，标记分子中的所有氢原子都可被取代，但机率各不相同。如各不相同。如G-3H-胆固醇。胆固醇。双标记及多标记双标记及多标记(double labeling and multiple labeling) 指在化合物分子的不同部位，引入二种或二种以上元素的同位素原子(如3H、14C)或引入一种元素的两种或两种以上同位素原子。双标记及多标记在同一机体或离体组织中可以同时观察两个指标。 放射性核素的选择放射性核素的选择 1、适宜的、适宜的T1/2；根据实验目的和实验设计选用合适的物理半衰期；根据实验目的和实验设计选用合适的物理半衰期 2、射线种类：

7、一般都选、射线种类：一般都选射线，其次是射线，其次是射线，射线，极少用；极少用； 3、合适的能量：体内示踪宜选用中等能量、合适的能量：体内示踪宜选用中等能量射线，体外示踪无特射线，体外示踪无特别要求；别要求； 4、稳定性要好，不脱标，不发生严重的辐射自分解；、稳定性要好，不脱标，不发生严重的辐射自分解； 5、其它：要求标记容易，价格可以接受，对产生射线的防护容易、其它：要求标记容易，价格可以接受，对产生射线的防护容易 放射性核素标记化合物的制备放射性核素标记化合物的制备1、同位素交换法同位素交换法：将需要标记的化合物：将需要标记的化合物AX和放射性化合物和放射性化合物BX*在在一定的条件下混合

8、，一定的条件下混合，X与与X*之间发生交换反应生成标记化合物之间发生交换反应生成标记化合物AX*，反应式如下：反应式如下： AX+BX*AX*+BX 如如125I-邻碘马尿酸钠邻碘马尿酸钠2、化学合成法化学合成法：以简单的放射化合物作原料，通过一定的化学反：以简单的放射化合物作原料，通过一定的化学反应后，把放射性原子结合在指定的位置上，得到所需要的，带放射应后，把放射性原子结合在指定的位置上，得到所需要的，带放射性的化合物。该法是放射标记化合物制备的主要方法。性的化合物。该法是放射标记化合物制备的主要方法。 3、生物合成法生物合成法：是将简单的放射性化合物在体内或体外置于生物：是将简单的放射性

9、化合物在体内或体外置于生物(动植物或微生物动植物或微生物)生长的环境中，利用生物体在代谢过程中对它的生长的环境中，利用生物体在代谢过程中对它的吸收利用而制得某些标记化合物。它又分为全生物合成与酶促合成吸收利用而制得某些标记化合物。它又分为全生物合成与酶促合成两种方法。两种方法。 (1)全生物合成全生物合成：常采用细菌、绿藻、酵母等低等生物来进行，这：常采用细菌、绿藻、酵母等低等生物来进行，这些低等生物很容易在实验室内培育，且代谢活泼，繁殖迅速，因而些低等生物很容易在实验室内培育，且代谢活泼，繁殖迅速，因而制备效率高，成本很低。制备效率高，成本很低。 (2)酶促合成酶促合成：可使用纯酶，酶制剂或

10、含有酶的组织促进合成反应，：可使用纯酶，酶制剂或含有酶的组织促进合成反应，也可以看作是应用也可以看作是应用 4、络（螯）合物生成法：根据金属离子生成络合物原理，将放射、络（螯）合物生成法：根据金属离子生成络合物原理，将放射性金属离子和特定功能化合物进行络合反应，标记快速、定量、简性金属离子和特定功能化合物进行络合反应，标记快速、定量、简便。便。14C（5730年）标记化合物合成：年）标记化合物合成：化学合成化学合成 、全生物合成、酶促、全生物合成、酶促合成合成3H（12.35年）标记化合物合成：年）标记化合物合成：同位素交换法（氚气暴射交换、同位素交换法（氚气暴射交换、催化交换）催化交换）化学

11、合成（催化加氢、卤素置换、氚化金属还原法）、酶促合成化学合成（催化加氢、卤素置换、氚化金属还原法）、酶促合成131I和和125I标记化合物的制备标记化合物的制备 ：125I是广泛用于体外放射分析试剂的标记制备，它的特点是，是广泛用于体外放射分析试剂的标记制备，它的特点是，T1/2为为60天，天，核丰度高核丰度高(95%)，能发射能发射28 kev和和35 kev能量能量的的射线射线(能量不高能量不高)，稳定好。稳定好。碘标记方法：碘标记方法： (一一) 125I标记蛋白和多肽标记蛋白和多肽1、氯胺氯胺-T法法：氯胺：氯胺T(N-氯代对甲苯磺酰胺钠盐氯代对甲苯磺酰胺钠盐)是一种氧化剂是一种氧化剂

12、使放射性使放射性Na I溶液中的溶液中的I-氧化成氧化成 I2，然后取代酪氨酸残基芳香环上，然后取代酪氨酸残基芳香环上的氢。的氢。2 、乳过氧化物酶法乳过氧化物酶法：过氧化物酶催化过氧化氢生成氧气，氧化：过氧化物酶催化过氧化氢生成氧气，氧化I-成成 (I2)，然后取代酪氨酸残基芳香环上的氢。，然后取代酪氨酸残基芳香环上的氢。3、固相氧化法固相氧化法：将氧化物（：将氧化物（Iodogen）或过氧化物酶制成固体颗粒）或过氧化物酶制成固体颗粒或交联在固体支持物上进行液或交联在固体支持物上进行液-固氧化反应。固氧化反应。4、联接标记联接标记： 将将125I标记在活泼试剂（含酰基化合物）上，后通标记在活

13、泼试剂（含酰基化合物）上，后通过（酰基与蛋白或多肽的游离氨基）缩合反应制成。过（酰基与蛋白或多肽的游离氨基）缩合反应制成。 （二）（二）同位素交换法同位素交换法 含碘有机化合物与无机放射性碘化物发生同含碘有机化合物与无机放射性碘化物发生同位素交换反应而制成位素交换反应而制成 。AI+NaI*AI*+NaI 131I-MIBG间碘苄胍间碘苄胍32P、33P、35S标记化合物制备：标记化合物制备：化学合成化学合成 、生物合成、酶促合成、生物合成、酶促合成、同位素交换法同位素交换法32P-核苷酸合成：核苷酸合成： - 32P-ATP或或- 32P-ATP ATP + 3-磷酸甘油磷酸甘油 3-磷酸甘

14、油激酶磷酸甘油激酶 1，3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸+ ADP Mg2+H332PO4- 32P-ATP 强碱阴离子交换柱强碱阴离子交换柱 活性炭吸附活性炭吸附纯化纯化- 32P-ATP核酸和反义寡核苷酸标记核酸和反义寡核苷酸标记核酸的核酸的125I标记：标记： DNA单链单链DNA +Na 125ITlCl3125I2125I-DNA 反义寡核苷酸反义寡核苷酸125I标记（标记（ 125I ASON，antisense oligonucleotide）1、ASON与酪与酪 胺连接：胺连接： 将含酪将含酪 胺的核苷酸单体通过合成仪连接在胺的核苷酸单体通过合成仪连接在ASON的的5端碱基，再将端

15、碱基，再将125I连到酪连到酪 胺的苯环上。（用胺的苯环上。（用氯胺氯胺-T氧化氧化Na 125I获得获得125I2）2、碘间接标记、碘间接标记ASON ： 制备制备5端硫代端硫代ASON与含碘嘧啶环结合，与含碘嘧啶环结合，稳定性碘原子被稳定性碘原子被125I取代而制成。取代而制成。3、3H- ASON 同位素交换法进行非定位标记同位素交换法进行非定位标记4、 32P- ASON： 在寡核苷酸在寡核苷酸5端通过端通过T4多核苷酸激酶催化连接多核苷酸激酶催化连接- 32P-ATP而制得。而制得。放射性标记化合物的纯化与鉴定放射性标记化合物的纯化与鉴定 标记率标记率： 指放射性核素被标记到待标记化

16、合物上的量占放射性投指放射性核素被标记到待标记化合物上的量占放射性投入量的百分比，即：入量的百分比，即： 标记率标记率(%)=标记物的放射性标记物的放射性/投入的总放射性投入的总放射性100%。标记物的分离纯化标记物的分离纯化：色谱法，又叫：色谱法，又叫层析法层析法，范围很广，主要有纸层，范围很广，主要有纸层析、薄板层析、柱层析等，另外还有析、薄板层析、柱层析等，另外还有透析法、电泳法透析法、电泳法。其中柱层析。其中柱层析法中的凝胶过滤法是一种高效、温和的纯化方法，在蛋白和肽类的法中的凝胶过滤法是一种高效、温和的纯化方法，在蛋白和肽类的标记化合物的纯化中得到广泛的应用。标记化合物的纯化中得到广

17、泛的应用。标记物的鉴定标记物的鉴定 (一一) 放射化学纯度：包括放射性纸层析法、放射性高效液相层析放射化学纯度：包括放射性纸层析法、放射性高效液相层析法、放射性凝胶电泳法等。法、放射性凝胶电泳法等。 (二二) 放射性浓度：取放射性浓度：取1ml产品，测其放射性活度，即为放射性浓产品，测其放射性活度，即为放射性浓度，单位为度，单位为Bq/ml。 (三三) 放射性比活度测定：放射性比活度放射性比活度测定：放射性比活度=放射性浓度放射性浓度/化学纯度化学纯度（Bq/mmol） (四四) 生物活性、免疫活性测定生物活性、免疫活性测定 放射性标记化合物的辐射自分解放射性标记化合物的辐射自分解 辐射自分解

18、辐射自分解(autoradiolysis) ：由于标记化合物分子所含放射性：由于标记化合物分子所含放射性核素电离辐射的作用，致使标记化合物本身的结构被破坏而丧核素电离辐射的作用，致使标记化合物本身的结构被破坏而丧失原有特性的现象。辐射自分解还会产生放射化学杂质或化学失原有特性的现象。辐射自分解还会产生放射化学杂质或化学杂质。杂质。辐射自分解的方式辐射自分解的方式1、初级内分解初级内分解(primary internal decomposition)：指标记核素本身：指标记核素本身的衰变，引起带有该核素的标记物分子结构发生变化，目前还不能的衰变，引起带有该核素的标记物分子结构发生变化，目前还不能

19、人为加以控制。例如，人为加以控制。例如，3 H每年有每年有5%变成变成3He，14C每年有每年有0.01%变变成成14N，这样化合物的性质就发生了改变。，这样化合物的性质就发生了改变。2、初级外分解初级外分解(primary external decomposition):标记核素所发出的标记核素所发出的射线直接作用于标记化合物分子，造成电离、激发或化学键断裂。射线直接作用于标记化合物分子，造成电离、激发或化学键断裂。比放射性愈高，标记分子愈集中，这种作用愈明显。比放射性愈高，标记分子愈集中，这种作用愈明显。 3、次级分解次级分解(secondary decomposition)：射线首先作用

20、于标记化：射线首先作用于标记化合物临近的分子合物临近的分子(如水分子如水分子)，使其产生激活物质或称自由基，这些，使其产生激活物质或称自由基，这些自由基化学性质活泼，可以作用于标记化合物分子，产生断键、氧自由基化学性质活泼，可以作用于标记化合物分子，产生断键、氧化及分解作用。化及分解作用。影响辐射自分解的因素影响辐射自分解的因素1、与标记化合物吸收射线能量的效率有关：不同种类的射线，电、与标记化合物吸收射线能量的效率有关：不同种类的射线，电离密度不同，电离密度越大，吸收射线能量的效率越高。离密度不同，电离密度越大，吸收射线能量的效率越高。2、与标记化合物的比活度有关：标记化合物的比活度愈高，化

21、合、与标记化合物的比活度有关：标记化合物的比活度愈高，化合物分子集中，相互间愈易受到自身射线的照射而使辐射自分解加重。物分子集中，相互间愈易受到自身射线的照射而使辐射自分解加重。3、与标记化合物的纯度有关：杂质的存在，特别是那些容易被电、与标记化合物的纯度有关：杂质的存在，特别是那些容易被电离辐射所激发、分解、产生自由基的杂质，可加速辐射自分解，且离辐射所激发、分解、产生自由基的杂质，可加速辐射自分解，且随着时间的延长而逐渐加快。随着时间的延长而逐渐加快。控制辐射自分解的方法控制辐射自分解的方法 1、降低标记化合物的比活度：辐射自分解的速度与比活度成正比，、降低标记化合物的比活度：辐射自分解的

22、速度与比活度成正比，贮存时应根据实际工作需要，将标记化合物用同种化合物贮存时应根据实际工作需要，将标记化合物用同种化合物(即载体即载体)稀释到所需的比活度。稀释到所需的比活度。2、选择适当的溶剂：选择溶剂的要求是：、选择适当的溶剂：选择溶剂的要求是：具有优良的耐辐射性；具有优良的耐辐射性；要能够溶解标记物；要能够溶解标记物；所加溶剂为避免引入杂质要经蒸馏法纯化。所加溶剂为避免引入杂质要经蒸馏法纯化。 3、加入自由基清除剂：常用少量、加入自由基清除剂：常用少量(1%3%)乙醇。乙醇。4、降低贮存温度：温度降低，自由基与标记分子相作用的反应速、降低贮存温度：温度降低，自由基与标记分子相作用的反应速

23、度也降低，从而辐射自分解也降低。度也降低，从而辐射自分解也降低。 氚在标记化合物分子内的稳定性：氚在标记化合物分子内的稳定性：3H标记化合物在实验核医学中应用较多，但标记化合物在实验核医学中应用较多，但3H标记化合物在贮存标记化合物在贮存和使用中，不及和使用中，不及14C标记化合物稳定，除易发生辐射自分解而形成标记化合物稳定，除易发生辐射自分解而形成放化杂质外，还可与周围溶剂发生交换反应而脱放化杂质外，还可与周围溶剂发生交换反应而脱3H，脱，脱3H的程度的程度与标记化合物中与标记化合物中3H原子的位置有关。一般来说，在巯基原子的位置有关。一般来说，在巯基(-SH)、胺、胺基基(-NH2)、羧基

24、、羧基(-COOH)、亚胺基、亚胺基(=NH)上标记的上标记的3H原子是不稳原子是不稳定的定的。放射核素示踪技术放射核素示踪技术放射核素示踪技术（放射核素示踪技术（radionuclide tracing techniques）:利用放射性核素及其标记化合物利用放射性核素及其标记化合物作为示踪剂，应用射线探测方法来检测它的行作为示踪剂，应用射线探测方法来检测它的行踪，以研究示踪剂在生物体系或外界环境中运踪，以研究示踪剂在生物体系或外界环境中运动规律的核技术动规律的核技术基本原理：基本原理：一、一、同一性同一性 放射性核素及其标记化合物和相放射性核素及其标记化合物和相应的非标记化合物具有相同的化

25、学及生物学性应的非标记化合物具有相同的化学及生物学性质，在体内化学及生理代谢变化过程相同；质，在体内化学及生理代谢变化过程相同；二、二、可测性可测性 放射性核素能发出各种不同的射线，放射性核素能发出各种不同的射线，可被放射性探测仪器所测定或被感光材料所记可被放射性探测仪器所测定或被感光材料所记录。而稳定性核素标记物则不然。录。而稳定性核素标记物则不然。主要特点主要特点 1.灵敏度高灵敏度高：最精确的化学分析只能测：最精确的化学分析只能测10-12 g水水平，而放射性示踪技术可测出平，而放射性示踪技术可测出10-1410-18 g水平，水平，因而对研究体内或体外实验系统内的微量物质具因而对研究体

26、内或体外实验系统内的微量物质具有特别价值。有特别价值。 2.检测方法简单多样检测方法简单多样。对待测物不必进行纯化或。对待测物不必进行纯化或分离，对发射分离，对发射射线示踪剂，可从体表测量。射线示踪剂，可从体表测量。3.合乎生理条件合乎生理条件：许多被研究的物质是系统内原有：许多被研究的物质是系统内原有的成分，并且通常处于动态平衡状态，其含量及的成分，并且通常处于动态平衡状态，其含量及分布维持稳定状态。用放射性核素及其标记化合分布维持稳定状态。用放射性核素及其标记化合物所用示踪量足以用核探测仪器测出，但是其化物所用示踪量足以用核探测仪器测出，但是其化学量可以是很少的，引入后几乎不会改变体内原学

27、量可以是很少的，引入后几乎不会改变体内原有物质的含量，所以基本上不会改变体内或体外有物质的含量，所以基本上不会改变体内或体外系统的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状系统的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状态物质的变化，准确可靠。态物质的变化，准确可靠。4.能定位和定性，在生物医学中应用广泛能定位和定性，在生物医学中应用广泛。比如利。比如利用用RAG可检测示踪剂在组织、细胞内的分布情可检测示踪剂在组织、细胞内的分布情况等。用磷屏扫描仪可定性定量检测示踪剂况等。用磷屏扫描仪可定性定量检测示踪剂 。广泛用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、遗广泛用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、遗传学和基因工程

28、研究。传学和基因工程研究。放射性核素示踪技术的基本环节放射性核素示踪技术的基本环节一、一、放射性制剂的选择放射性制剂的选择1、核素标记位置核素标记位置的选择的选择 科研选用核素标记化合物科研选用核素标记化合物的标记位置要能满足研究目的需要。若观察分子上的标记位置要能满足研究目的需要。若观察分子上某基团或原子去向，应选择定位标记，必要时用双某基团或原子去向，应选择定位标记，必要时用双标记，避免将示踪原子标记在可交换位置，且在实标记，避免将示踪原子标记在可交换位置，且在实验过程中核素不能脱标。验过程中核素不能脱标。2、选择合适、选择合适射线射线 进行进行体内示踪、功能测定或显体内示踪、功能测定或显

29、像检查像检查时选择仅发射时选择仅发射射线的核素；微观放射自显射线的核素；微观放射自显影研究影研究生物代谢生物代谢宜选择发射宜选择发射射线的核素射线的核素3H14C35S3、核素纯度和化学纯度核素纯度和化学纯度 进行示踪研究时，做靶的物质不纯，进行示踪研究时，做靶的物质不纯，则产物中就可搀杂另一种放射性核素，以此示踪将得不到正确实则产物中就可搀杂另一种放射性核素，以此示踪将得不到正确实验结果。验结果。4、选择合适半衰期核素选择合适半衰期核素 根据实验需要选择具合适半衰期的根据实验需要选择具合适半衰期的核素。对动物代谢实验，可选择半衰期较长的核素核素。对动物代谢实验，可选择半衰期较长的核素3H、1

30、4C标记标记的示踪剂，体外放射分析，则多选用的示踪剂，体外放射分析，则多选用125I。5、放射性活度和发射射线能量放射性活度和发射射线能量的选择的选择 同种射线粒子，能量同种射线粒子，能量越高，穿透和电离能力越强，辐射生物效应就越明显。这就要求越高，穿透和电离能力越强，辐射生物效应就越明显。这就要求在满足示踪量的前提下尽量降低活度以减少机体吸收剂量，防止在满足示踪量的前提下尽量降低活度以减少机体吸收剂量，防止有害的辐射效应，同时比活度过高也会导致辐射自分解。另外，有害的辐射效应，同时比活度过高也会导致辐射自分解。另外，功能测定或显像检查功能测定或显像检查时选择仅发射时选择仅发射射线的核素，细胞

31、射线的核素，细胞水平分子生物示踪研究时，宜选择发射低能水平分子生物示踪研究时，宜选择发射低能射线的核射线的核素素3H、14C二、二、示踪剂用量示踪剂用量 包括示踪剂的放射性活度和化学量。示踪剂化学量极少，一包括示踪剂的放射性活度和化学量。示踪剂化学量极少，一般不会影响示踪结果，所以主要考虑活度，包括：实验中被稀释般不会影响示踪结果，所以主要考虑活度，包括：实验中被稀释程度；示踪实验周期；示踪剂利用率；在体内的分布和排出；辐程度；示踪实验周期；示踪剂利用率；在体内的分布和排出；辐射生物效应；安全剂量；测量仪器的灵敏度。综合上述因素，可射生物效应；安全剂量；测量仪器的灵敏度。综合上述因素，可参考下

32、列公式：参考下列公式： ACK/DB A: 示踪剂放射性活度示踪剂放射性活度(dpm/ml) B: 本底计数率、本底计数率、 C: 示踪剂容积示踪剂容积(ml) K: 测量仪器的灵敏度、探测效率测量仪器的灵敏度、探测效率 D：实验中稀释倍数：实验中稀释倍数 一般而言，小动物实验用量一般而言，小动物实验用量0.2-0.5Ci,多在多在10 Ci以下以下;离体实验离体实验用量小于用量小于1或几或几Ci。放射性生物样品的制备放射性生物样品的制备根据所测根据所测组织、脏器及核素种类、活度组织、脏器及核素种类、活度采用不同样品制备方式。采用不同样品制备方式。（一）注意事项（一）注意事项 为避免放射性污染

33、和辐射防护，应注意：为避免放射性污染和辐射防护，应注意：1、防止放射性生物样品沾染工作人员体表或经消化道、呼吸道、防止放射性生物样品沾染工作人员体表或经消化道、呼吸道进入人体。进入人体。2、防止工作场所放射性污染（地面、操作台、墙壁）、防止工作场所放射性污染（地面、操作台、墙壁）3、采样应有代表性和均匀性、采样应有代表性和均匀性4、称重时防止样品污染干燥箱、天平等、称重时防止样品污染干燥箱、天平等5、向动物体内引入活度较高示踪剂时注意外照射防护、向动物体内引入活度较高示踪剂时注意外照射防护（二）（二）样品制备样品制备1、燃烧法燃烧法 密闭容器内放生物样品，充氧后样品燃烧，样品中密闭容器内放生物

34、样品，充氧后样品燃烧，样品中14C 3H转变为转变为14CO2 ， 3H2O ，用苯乙胺或乙醇胺，用苯乙胺或乙醇胺 吸收吸收14CO2 ，用无水乙醚吸收用无水乙醚吸收3H2O。然后液体闪烁仪测量。然后液体闪烁仪测量。2、消化法消化法 在酸或碱性溶液中，大分子样品水解为易溶小分子物在酸或碱性溶液中，大分子样品水解为易溶小分子物质，加入闪烁剂进行液体闪烁测量。质，加入闪烁剂进行液体闪烁测量。3、示踪剂制备示踪剂制备,用用灰化法灰化法-使样品中有机物氧化使样品中有机物氧化,可细分为可细分为:湿灰化法湿灰化法 加氧化剂使样品中有机物氧完全化加氧化剂使样品中有机物氧完全化干灰化法干灰化法 用电炉高温灰化

35、用电炉高温灰化,挥发性的示踪样品不适合挥发性的示踪样品不适合.1) 拟湿灰化法拟湿灰化法 用浓硝酸或氢氧化钠使示踪剂样品完全溶解用浓硝酸或氢氧化钠使示踪剂样品完全溶解,对对脂肪含量大的样品以有机溶剂溶解脂肪含量大的样品以有机溶剂溶解,得到均匀溶液得到均匀溶液. (三三)临床核医学显像临床核医学显像 根据需要选用根据需要选用照相机、照相机、SPECT PET进行组织脏器显像。进行组织脏器显像。（四）（四）结果分析：结果分析：根据实验目的、示踪剂类型、数据处理方式分析结果。根据实验目的、示踪剂类型、数据处理方式分析结果。对体外放射分析结果，要遵循放免质量控制指标，结合正常值对体外放射分析结果，要遵

36、循放免质量控制指标，结合正常值分析；分析；对功能测定和显像检测结果，结合临床表现、病理变化和图象对功能测定和显像检测结果，结合临床表现、病理变化和图象特征进行综合分析。特征进行综合分析。示踪实验中的同位素效应示踪实验中的同位素效应(一一)同位素效应同位素效应：物质转化时，如分子中某一原：物质转化时，如分子中某一原子被它的同位素所取代，虽然反应性质不变，有子被它的同位素所取代，虽然反应性质不变，有时却会发生反应速度的改变，称为同位素效应时却会发生反应速度的改变，称为同位素效应(isotope effect)。 (二二)同位素效应同位素效应的类型的类型1.初级同位素效应初级同位素效应：反应直接涉及

37、同位素所在的键时，同：反应直接涉及同位素所在的键时，同位素效应比较严重，称初级同位素效应位素效应比较严重，称初级同位素效应(primary isotope effect)。 2.次级同位素效应次级同位素效应：同位素效应发生在邻近的化学键称继：同位素效应发生在邻近的化学键称继发同位素效应或次级同位素效应发同位素效应或次级同位素效应(second isotope effect)。3.溶剂同位素效应溶剂同位素效应：溶剂中某种原子被同位素取代后影响：溶剂中某种原子被同位素取代后影响溶质的反应速度称之。溶质的反应速度称之。4.生物体系的同位素效应生物体系的同位素效应：示踪剂引入生物体后，由于同：示踪剂引

38、入生物体后，由于同位素效应的存在会影响有关的各种生化反应，这种情况称位素效应的存在会影响有关的各种生化反应，这种情况称为生物体系的同位素效应。为生物体系的同位素效应。基本类型、方法及注意事项基本类型、方法及注意事项 (一一)类型：根据实验的目的不同，可分以下几种类型：类型：根据实验的目的不同，可分以下几种类型：1.整体示踪实验整体示踪实验：指将标记物引入完整的机体，从体外：指将标记物引入完整的机体，从体外或取标本观察标记物的去向，以了解机体在生理、病理或取标本观察标记物的去向，以了解机体在生理、病理过程中物质的分布及运动转化规律，主要用于研究物质过程中物质的分布及运动转化规律，主要用于研究物质

39、在体内的吸收，分布、代谢和排泄等运动规律以及研究在体内的吸收，分布、代谢和排泄等运动规律以及研究机体组织器官的功能和形态变化。机体组织器官的功能和形态变化。2.离体示踪实验离体示踪实验：指从整体中分离出来的组织或细胞等：指从整体中分离出来的组织或细胞等简单系统进行的实验。多用于某些特定物质如蛋白质、简单系统进行的实验。多用于某些特定物质如蛋白质、核酸等的转化规律以及某些精细结构的功能研究。核酸等的转化规律以及某些精细结构的功能研究。3.双标记示踪实验双标记示踪实验：其原理就是将两个研究对象包括两：其原理就是将两个研究对象包括两种分子或是一种分子的两种形态或是一种分子的两个种分子或是一种分子的两

40、种形态或是一种分子的两个部分，分别带上示踪原子，通过采用相应的测量方法，部分，分别带上示踪原子，通过采用相应的测量方法，分析两种标记原子的量，观察它们经过运动转化前后分析两种标记原子的量，观察它们经过运动转化前后比值的变化，判断该两种观察对象是否具有相同的运比值的变化，判断该两种观察对象是否具有相同的运转规律。转规律。1. 实验类型的选择实验类型的选择(补充补充)：其选择的原则有：其选择的原则有： 研究整体吸收、分布、转运、排泄等问题，只能选择整体示踪研究整体吸收、分布、转运、排泄等问题，只能选择整体示踪实验。实验。 物质在精细结构中的运动规律，可首先考虑离体示踪实验，最物质在精细结构中的运动

41、规律，可首先考虑离体示踪实验，最好有整体实验加以验证。好有整体实验加以验证。 物质转化的研究以离体实验为宜，必要时也应加以整体示踪实物质转化的研究以离体实验为宜，必要时也应加以整体示踪实验。验。 直接观察细胞内的物质转化，而且该物质的标记物又无法直接直接观察细胞内的物质转化，而且该物质的标记物又无法直接引入细胞时，可以选择脉冲标记法，也可以用加入示踪物的前身标引入细胞时，可以选择脉冲标记法，也可以用加入示踪物的前身标记物法，该前身标记物进入细胞，在细胞内发生记物法，该前身标记物进入细胞，在细胞内发生“示踪物前身示踪物前身示示踪物踪物代谢产物代谢产物”的转变，获得的转变，获得“示踪物示踪物代谢产

42、物代谢产物”的信息。的信息。 对某些研究，用离体实验方法易导致错误结论，或离体实验本对某些研究，用离体实验方法易导致错误结论，或离体实验本身的短时性不能给出应有结果时，应采用整体实验。身的短时性不能给出应有结果时，应采用整体实验。实验阶段实验阶段 (1)示踪剂量的估算：示踪剂量的估算不能用简单的公式示踪剂量的估算：示踪剂量的估算不能用简单的公式来估算，应该综合考虑。来估算，应该综合考虑。 稀释作用：放射性核素标记化合物进入机体后，一般稀释作用：放射性核素标记化合物进入机体后，一般要求放射性活度在整个实验过程中，经稀释后所制得的放要求放射性活度在整个实验过程中，经稀释后所制得的放射性样品不能低于

43、本底计数。射性样品不能低于本底计数。 组织的浓聚作用：由于某些放射性核素有亲某种组织组织的浓聚作用：由于某些放射性核素有亲某种组织的特性，有的放射性核素进入机体后不是完全均匀被稀释，的特性，有的放射性核素进入机体后不是完全均匀被稀释，而可能选择性地蓄积到某些器官、组织而浓聚。如而可能选择性地蓄积到某些器官、组织而浓聚。如131I进进入体内后，有入体内后，有30%或更高可被甲状腺摄取，给予剂量时就或更高可被甲状腺摄取，给予剂量时就要考虑这个特异性。要考虑这个特异性。 实验周期及安全剂量：根据试验周期长短，实验分析方实验周期及安全剂量：根据试验周期长短，实验分析方法，给予途径等进行安全剂量估算。如

44、，示踪剂引入机体，法，给予途径等进行安全剂量估算。如，示踪剂引入机体，要求基本不改变该物质在体内的浓度。药物研究时其化学要求基本不改变该物质在体内的浓度。药物研究时其化学量不应超过临床剂量，动物实验时在不中毒的前提下可适量不应超过临床剂量，动物实验时在不中毒的前提下可适当增大剂量。体外示踪实验可用比活度较低的标记物。当增大剂量。体外示踪实验可用比活度较低的标记物。 对于非均匀分布的标记物还应根据实验情况对于非均匀分布的标记物还应根据实验情况(实验周期实验周期长短、标记物的生物半衰期，标记物在拟观察的脏器中分长短、标记物的生物半衰期，标记物在拟观察的脏器中分布的百分数，能取得的样品量，测量上最低

45、需多少布的百分数，能取得的样品量，测量上最低需多少dpm等等)作一系列估算。作一系列估算。(2)示踪剂引入途径：根据实验类型和目的，对整体动物示踪剂引入途径：根据实验类型和目的，对整体动物实验可采用静脉、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌实验可采用静脉、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌胃等。胃等。(3)放射性样品的制备：样品的制备就为测量，测量的形放射性样品的制备：样品的制备就为测量，测量的形式主要有三类：式主要有三类：取取标本标本在体外测放射性；在体外测放射性；制成不同水平的制成不同水平的切片切片作作放射自显影放射自显影；从体外测从体外测整体内的放射性。因此样品制备就要适应不整体内的放射性。因

46、此样品制备就要适应不同测量类型同测量类型。 (4)数据处理：放射性示踪实验结果可根据不同目的选用数据处理：放射性示踪实验结果可根据不同目的选用不同参数表示，含义也各不相同，概括为以下几种。不同参数表示，含义也各不相同，概括为以下几种。 整个脏器的整个脏器的总放射性活度总放射性活度：主要用于研究：主要用于研究物质分布物质分布的的实验以实验以反映各脏器的相对分布量反映各脏器的相对分布量。对于不同个体的同一脏。对于不同个体的同一脏器来说，该参数与各个体接受的剂量成正比，故各个体的器来说，该参数与各个体接受的剂量成正比，故各个体的剂量不同时应换算成所给剂量的剂量不同时应换算成所给剂量的%，或对剂量进行

47、校正。，或对剂量进行校正。 放射性含量放射性含量：dpm/mg组织或组织或ml体液、体液、dpm/mg蛋白蛋白或或DNA等。用以等。用以反映不同组织浓集某种物质的能力反映不同组织浓集某种物质的能力。对。对不同个体来说，该参数与单位体重接受的剂量成正比，故不同个体来说，该参数与单位体重接受的剂量成正比，故要求各个体接受的剂量按单位体重计算是相等的，否则应要求各个体接受的剂量按单位体重计算是相等的，否则应作相应的校正。作相应的校正。比活度比活度：dpm/mmol或或mg化合物。主要用于研究内化合物。主要用于研究内源性物质的动态分布或代谢。它受三个因素的影响，源性物质的动态分布或代谢。它受三个因素的

48、影响，即与引入的放射性活度成正比；与组织中非标记物含即与引入的放射性活度成正比；与组织中非标记物含量成反比；与示踪物被清除的速度成反比。量成反比；与示踪物被清除的速度成反比。相对比活度相对比活度：两个解剖部位中同一化合物比活度的：两个解剖部位中同一化合物比活度的比值或两种化合物比活度的比值。用于反映组织中某比值或两种化合物比活度的比值。用于反映组织中某物质的来源及组织与血液交换的速率，可排除血液中物质的来源及组织与血液交换的速率，可排除血液中比活度不恒定的影响。比活度不恒定的影响。放射性核素稀释法放射性核素稀释法 放射性核素稀释法放射性核素稀释法(radionuclide dilution t

49、echnique)即用即用适当的放射性核素标记化合物作为示踪剂，利用化学上适当的放射性核素标记化合物作为示踪剂，利用化学上的稀释原理对微量物质作定量分析，或测定液体容量的的稀释原理对微量物质作定量分析，或测定液体容量的方法。方法。基本原理基本原理 依据物质在稀释前后质量不变的原理，依据物质在稀释前后质量不变的原理，放射性物质在被稀释前后，其放射性活度也不会改变。放射性物质在被稀释前后，其放射性活度也不会改变。但是，由于被稀释，它的单位质量或体积内的放射性活但是，由于被稀释，它的单位质量或体积内的放射性活度度(即比活度或放射性浓度即比活度或放射性浓度)降低了。降低了。设质量为设质量为m1的标记物

50、的比活度为的标记物的比活度为s1与质量为与质量为m2的同一种化的同一种化学形态的非示记物均匀混合，则标记物被非标记分子所稀学形态的非示记物均匀混合，则标记物被非标记分子所稀释，混合物的比活度为释，混合物的比活度为s2，混合前后的总放射性应相等。，混合前后的总放射性应相等。即：即： s2(m1+m2)=s1m1(61) 如果如果m1和和m2中有一个量为已知，只需测定混匀后样品中有一个量为已知，只需测定混匀后样品(取任意量取任意量)的比活度，就可算出另一量。的比活度，就可算出另一量。基本方法基本方法 (一一)核素正稀释法核素正稀释法(direct nuclide dilution)：用已知量：用已

51、知量的标记物测定未知量的非标记物的稀释法称为核素正稀的标记物测定未知量的非标记物的稀释法称为核素正稀释法。方法要点是：将一定量已知比放射性的标记化合释法。方法要点是：将一定量已知比放射性的标记化合物与其非标记化合物的分子均匀混合，直接测定该混合物与其非标记化合物的分子均匀混合，直接测定该混合样品的比放射性，亦可进行提纯后测定该样品的比放射样品的比放射性，亦可进行提纯后测定该样品的比放射性。根据比放射性的降低来计算非标记化合物的含量。性。根据比放射性的降低来计算非标记化合物的含量。设：设：m1标记化合物的量；标记化合物的量；A标记化合物的放射性；标记化合物的放射性；S1标标记化合物的比活度；记化

52、合物的比活度；S2稀释后混合液的比活度；稀释后混合液的比活度；mx样品中待测化合物的量样品中待测化合物的量根据公式根据公式 S2(m1+m2)=S1m1得：得： mx=m(S1/S2-1)某样品内含有微量磷酸钠某样品内含有微量磷酸钠(Na3PO4)，加，加32P标记的磷酸钠标记的磷酸钠(Na332PO4)0.05 mg，其放射性计数为，其放射性计数为1950 cpm，混匀后，混匀后分离得纯品磷酸钠分离得纯品磷酸钠0.1 mg，放射性计数为，放射性计数为600 cpm，求样，求样品中磷酸钠的含量。品中磷酸钠的含量。解 ： 已 知解 ： 已 知 A = 1 9 5 0 c p m , m1= 0

53、. 0 5 m g , S1=1950/0.05=39000(cpm/mg)S2=600/0.1=6000 cpm/mg,代入式代入式62得：得：mx=0.05(390006000-1)=0.275 mg(二二)核素反稀释法核素反稀释法(inverse nuclide dilution)：用已知量的：用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的方法称之为核素反稀释非标记物测定样品中标记物含量的方法称之为核素反稀释法。方法要点是：在体内示踪实验时，设标记物的化学量法。方法要点是：在体内示踪实验时，设标记物的化学量为为mx，已知标记物的比活度为，已知标记物的比活度为S1，加入非标记物的化学，加入非标记

54、物的化学量为量为m，均匀后分离出纯品，均匀后分离出纯品(标记物标记物+非标记物非标记物)的比活度为的比活度为S2，根据稀释法的基本公式，根据稀释法的基本公式(62)，得：，得：mx=m S2/S1-S2 (63)这就是反稀释法基本公式。这就是反稀释法基本公式。凡是标记物在样品中的化学量少，并混有放射性杂质，凡是标记物在样品中的化学量少，并混有放射性杂质，欲求其含量，只要知道该标记物的比活度，都可用反稀释欲求其含量，只要知道该标记物的比活度，都可用反稀释法进行定量。法进行定量。用用14CO2通过植物光合作用生成放射性蛋白质，取其中通过植物光合作用生成放射性蛋白质，取其中少量蛋白质经水解后分离出部

55、分谷氨酸测得比活度为少量蛋白质经水解后分离出部分谷氨酸测得比活度为254 dpm/mg，欲求谷氨酸的含量，取，欲求谷氨酸的含量，取126 mg放射性蛋放射性蛋白样品，水解后加入非标记谷氨酸白样品，水解后加入非标记谷氨酸10.7 mg，混匀后分，混匀后分出少部分谷氨酸测比活度为出少部分谷氨酸测比活度为382 dpm/mg。求标记谷氨。求标记谷氨酸的量及蛋白中标记谷氨酸的重量百分比酸的量及蛋白中标记谷氨酸的重量百分比?解：已知解：已知m=10.7 mg S1=508 dpm/mg S2=382 dpm/mg，代入公式代入公式(63)得得mx=10.7382/508-382=32.44 (mg)标记

56、谷氨酸的量，则标记谷氨酸的重量百分比标记谷氨酸的量，则标记谷氨酸的重量百分比为：为：32.44126=25.7%。（二）放射性核素稀释法的应用放射性核素稀释法的应用 1、测定生理性物质的体内代谢库、测定生理性物质的体内代谢库 体内各种生理性物质体内各种生理性物质都有各自的分布范围，每个分布范围称为一个代谢库。利都有各自的分布范围，每个分布范围称为一个代谢库。利用同位素稀释法来测定活体各代谢库的大小几乎是绝大多用同位素稀释法来测定活体各代谢库的大小几乎是绝大多数物质整体代谢库的唯一有效方法。例如静脉注射少量高数物质整体代谢库的唯一有效方法。例如静脉注射少量高比活度的比活度的3 H-胆酸，待其在包

57、括血浆在内的代谢库混匀后胆酸，待其在包括血浆在内的代谢库混匀后取样测比活度，按稀释法原理即可算出体内包括血浆在内取样测比活度，按稀释法原理即可算出体内包括血浆在内的胆酸代谢库的大小。的胆酸代谢库的大小。2、整体内各种体液成分的量、整体内各种体液成分的量 整体内有些体液成分的量整体内有些体液成分的量也相对恒定，它们不一定是一种特定物质，因此习惯上不也相对恒定，它们不一定是一种特定物质，因此习惯上不称为代谢库，但是它们的变化有理论意义和临床实践意义。称为代谢库，但是它们的变化有理论意义和临床实践意义。测量它们总量的唯一办法也是同位素稀释法。下表是常用测量它们总量的唯一办法也是同位素稀释法。下表是常

58、用的几种体液成分测量法。的几种体液成分测量法。建立建立核素稀释法的条件核素稀释法的条件(注意事项注意事项) 1.标记物或非标记物与待测物质在化学性质上要相同。标记物或非标记物与待测物质在化学性质上要相同。 2.实验过程中，标记原子在化合物上要稳定，否则测定实验过程中，标记原子在化合物上要稳定，否则测定的比活度不准确。的比活度不准确。 3.标记物的放射化学纯度要高。标记物的放射化学纯度要高。 4.必须确保标记物与非标记物充分混匀，特别是体内稀必须确保标记物与非标记物充分混匀，特别是体内稀释实验时，由于有吸收、扩散等因素，完全混匀的时间，释实验时，由于有吸收、扩散等因素，完全混匀的时间，一般需经实

59、验确定。一般需经实验确定。 5.对混匀后的样品，要有可靠的分离、纯化方法。因为对混匀后的样品，要有可靠的分离、纯化方法。因为混匀后，样品的比活度恒定，所以样品的丢失不影响结果混匀后，样品的比活度恒定，所以样品的丢失不影响结果的准确性，可采用各种理化的方法进行纯化，以确保分离的准确性，可采用各种理化的方法进行纯化，以确保分离的样品纯净，测得可靠、准确的比活度。的样品纯净，测得可靠、准确的比活度。 物质转化的示踪研究物质转化的示踪研究 研究物质转化：要揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物、及研究物质转化：要揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物、及产物的关系，以完成某种转化的必要条件。这是目前最

60、常用最理想产物的关系，以完成某种转化的必要条件。这是目前最常用最理想的方法，可在整体、离体条件下进行，不但能够对前身物、中间物，的方法，可在整体、离体条件下进行，不但能够对前身物、中间物，产物作用定性分析，还可用来研究前身物转化为产物的速度，转化产物作用定性分析，还可用来研究前身物转化为产物的速度，转化的条件，转化的机制及各种因素对转化的影响等。的条件，转化的机制及各种因素对转化的影响等。 一、一、掺入实验掺入实验(incorporation experiment) (一一)基本原理：要研究生物体系中化合物基本原理：要研究生物体系中化合物A和和B是不是前身物和产是不是前身物和产物的关系，可将物