HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H2b)特异性细胞和体液免疫应答.

1、HBcAg DNA疫苗诱导小鼠(H2b)特异性细胞和体液免疫应答摘要 目的 观察HBcAg DNA疫苗(pJW4303/HBc)免疫C57BL/6小鼠 (H-2b)的特异性细胞和体液免疫应答。方法基因枪和肌肉注射两种方法接种DNA 疫苗；ELISA 法检测小鼠血清抗-HBc(IgG)及 IgG 亚类(lgG1,lgG2a) ；51铬 释放法检测小鼠脾细胞 HBcAg 特异性 CTL 活性。结果 该 DNA 疫苗体外可表达 HBcAg 小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗-HBc 滴度分别达 1 : 328050 和 1 : 109 350;肌肉注射组抗-HBc 亚类以 IgG2a 为主；两

2、种方法接种小鼠 的特异性 CTL 杀伤率分别达 53.1%和 52.8%。结论 HBcAg DNA 疫苗在 H-2b小鼠 实验中表现出良好的细胞免疫和体液免疫原性。关键词肝炎核心抗原，乙型DNA 疫苗小鼠Specific cellular and humoral immune resp on ses in H-2bmicein duced by DNA immuni zati on of HBV core geneHUANG Zuh u,LU Sha n, LIU Ni ng,et al.The First Affiliated Hospitalof Nanjing Medical Unive

3、rsity,Nanjing 210029Abstract Objective To observe the specific cellular and humoral immuneresponses in H-2bmice after DNA immunization of HBV core gen e.Methods The DNAvacci ne(pJW4303/HBc) was con structed by inserting HBV core gene fragment intothe reading frame of plasmid pJW4303.The immuni zati

4、on was performed by gene gunand in tramuscular injectio n in this experime nt.A nti-HBc(lgG)a nd itssubtypes(lgG1,lgG2a)i n mice sera were detected by ELISA.HBcAg specific cytotoxicT lymphocyte (CTL) activity was measured by51Chromium release assay.Results The expressi on of HBcAg was dem on strated

5、 byELISA and Western-blot in 293T cells tran sfected with pJW4303/HBc.The en d-po inttiters of serum an ti-HBc in immuni zed mice were 1 : 328 050 (gene gun method) and1: 109 350 (intramuscularmethod ).ln both groups of gene gun and in tramuscular immunization,IgG2a level wassightly higher than that

6、 of IgG1.HBcAg specific CTL activities were 53.1% in gene gungroup and 52.85%in in tramuscular group.C on clusi on The results showed that theDNA vacci ne of pJW4303/HBc had stro ng an tige necity in both cellular and humoralimmunity.Key words Hepatitis B core antigenDNA 疫苗（基因疫苗）是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域

7、，被称 之为DNA vaccine Mice疫苗的“第三次革命”。DNA 疫苗的显著特点之一是目的基因进入机体后 的表达产物系内源性抗原，主要通过 MHC4类途径激发机体的免疫应答，其中 特异性 CTL 应答尤为突出。大量资料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病 毒（HBV）慢性携带者体内针对 HBV 勺特异性 CTL 应答明显低下，纠正这种 CTL 低 反应状态，对于机体有效地清除 HBV 至关重要。鉴于 HBV 核心区基因产物 HBcAg 是机体 CTL 的主要靶抗原，我们构建了 HBcAg DNA 疫苗，并观察了该 DNA 疫苗经基因枪和肌肉注射法接种后 H-2b小鼠的特异性细胞和体液免疫

8、应答。材料与方法一、HBcAg DNAS 苗的构建将经过 5端修饰的 HBV 核心区基因片段:3：（购自中国预防医学科学院病毒 研究所）插入质粒 pUC18（Promega 的 Pstl 和 BamH 酶切位点，克隆成功后，再 将该重组质粒中含 HBV 核心区基因片段的 Hind III 和 BamH 酶切片段定向克隆 进质粒pJW4303 系真核表达质粒， 含 CMVIP 刻早期启动子， 由美国马萨诸塞大 学医学中心 HLRobinson 教授惠赠）的相应克隆位点。该重组质粒即为 HBcAg DNA 疫苗，命名为pJW4303/HBe二、pJW4303/HBc 体外表达产物的鉴定分别取纯化的

9、 pJW4303/HBc 和 pJW4303 无目的基因的对照质粒）约 20 卩 g，用磷酸钙法转染 293T 细胞（一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系），72 小时后收 集并裂解细胞，低温下离心取上清。该细胞裂解产物经间接 ELISA 法检出HBcAg 经 Western-blot 证实在 21Kd 处有一清晰蛋白质条带，与 HBcAg 分子量 相符；对照质粒的转染细胞裂解产物未检出HBcAg。三、pJW4303/HBc 和 pJW4303 的大量制备采用 QIAGEN Plasmid Purification（Giga）Kit（GIAGEN Inc.,Germany） 。 每2000mlHB1

10、01 转化株菌液可获高纯度质粒约 10mg四、小鼠来源、分组及血清标本采集68 周龄雌性 C57BL/6（H2）小鼠由美国马萨诸塞大学医学中心动物实验中 心提供。 共设 4 组， 每组 5 只小鼠， 耳洞法编号。 组别为 pJW4303/HBc 基因枪 组、 pJW4303基因枪组、pJW4303/HBc 肌内注射组及 pJW4303 肌内注射组。采用 毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠血清，-70C冻存。五、免疫方法及免疫程序（一） 基因枪法 基因枪为 Agrecetus Inc.（U.S.A） 产品，系高压氦气驱动类型。按 2 卩 m 质粒 DNA 1mg 金颗粒（1 卩 g,BIORAD）的比

11、例分别制备含 pJW4303和 pJW4303/HBc 的基因枪专用细管状子弹。每粒子弹含质粒DNA 1 卩 g。每只小鼠每次在腹部皮肤 6 处不同部位接受注射，基因枪所用压力为 400psi，接种剂 量为 6卩 g 质粒 DNA 次小鼠。根据文献报道，未设单纯金颗粒对照组：4：。（二）肌内注射法 取相应质粒 DNA 100 卩 g,以无菌生理盐水稀释至 100 卩 l。每只小鼠每次在其两后肢四头肌处各注射 50 卩 l，故接种剂量为 100 卩 g/次小鼠。（三）免疫程序 为 0 周、第 4 和第 8 周。每次免疫时接种方法及剂量相 同。每次免疫前及第 10 周时采集小鼠血清。六、抗 HBc

12、IgG 及 IgG 亚类检测（一） 抗-HBc-IgG 检测以重组 HBcAg 南京军区医学研究所张林元研究员惠赠）0.1 卩 g/100 卩 I 孔包被 96 孔 ELISA 板（Corning）。待测小鼠血清作系列 3 倍稀释（1 : 50, 1 ： 150, 1 : 4501 : 885735 0）。以生物素化羊抗鼠 IgG 和亲 和素偶联 HRP（Vector Laboratory Inc.）检测小鼠血清中抗 HBc 终点滴度。抗HBc 高滴度血清采用 CORZYM 试剂盒（Abbott）作抗 HBc 定量测定，并转换成 PEI（Paul Ehrlich In stitute） 单位。

13、（二） 抗 HBcIgG 亚类检测 以小鼠 IgG1, IgG2a 标准品、 HRP 标记的羊抗 鼠 IgG1或 lgG2a（Southern Biotechnology Associatesnc.）为主要试剂，分 别检测单个小鼠血清中抗 HBcIgG1 和 IgG2a 水平，根据 A（450nm）值计算 IgG2a/IgG1比值。七、特异性 CTL 功能测定PJW4303/HB （或 pJW4303 末次免疫 4 周（即第 12 周）时， 在麻醉状态、 无菌 条件下取小鼠脾脏，制备单个细胞悬液，分别用或不用H-2b小鼠限制性 HBcAg特异性 CTL 表位多肽：句 （序列为 MGLKFRQL

14、 终浓度为 10 卩 g/ml） 作体外刺激，37C培养 6 天。继以 EL4 细胞为靶细胞（用或不用上述多肽进行过夜孵育）作51Cr 释放试验（4 小时孵育法），测定 HBcAg 特异性 CTL 杀伤活性，效应细胞：靶 细胞范围为12 ： 10.5 ： 1。特异性 CTL 杀伤率（%）=（实验孔 Cr 释放值-自然 Cr 释放值）/（最大 Cr 释 放值-自然 Cr 释放值）X100。一、各组小鼠血清抗 HBc 终点滴度见表 1。接种 pJW4303/HB（后小鼠产生了较高滴度的抗 HBo 基因枪组的终 点滴度 3 倍于肌内注射组。经定量检测，终点滴度达1 : 109 350 及以上的血清标

15、本中，抗 HBc 含量均大于 900PEI 单位。pJW4303 接种后小鼠仅有低滴度非特 异性抗体反应（ 1 : 450）。二、单个小鼠血清抗 HBc 终点滴度的比较见 1。基因枪组各小鼠血清抗 HBc 的滴度表 1 各组小组血清抗 HBc 的终点滴度组别采样时间0 周 4 周8 周10 周PJW4303S因枪组50 150450450pJW4303/HBcS因枪组50 4050 109350 328050PJW4303 肌内注射组50 150150450PJW4303/HB（肌内注射组 50 405036450 1093501 个体小鼠血清抗 HBc 终点滴度高且均衡，4/5 达 1 :

16、328 050;而肌内注射组的抗体滴度则普遍降低 3 倍，最低 者仅 1 :4 050o三、单个小鼠血清抗 HBc 亚类比值见表 2。除基因枪组第 5 号小鼠外，两组其余小鼠的抗 HBclgG2a/lgG1 比 值均大于 1,提示以 IgG2a 为主。比较两组的平均 IgC2a/IgG1 比值，肌内注射 组显著高于基因枪组(PV0.05)。表 2 个体小鼠血清抗 HBcIgG 亚类比值(IgG2a/IgG1)组别小鼠序号2345v.imagesessays311024054552398 (859 bytes) src=/med/ca no/201003/201003151 94608900 1

17、4 22sPJW4303/HBc121.22.9 1.51.550.8基因枪组I2021I90PJW4303/HBc14.10.12. 315.肌内注射组423836955606*表中数值为 ELISA(A450nm 测定之 IgG2a/IgG1 比值 注：两组相比差异有显著性，PV0.05四、小鼠脾细胞 HBcAg 特异性 CTL 杀伤活性 见 2o2 小鼠脾细胞 HBcAg 特异性 CTL 杀伤活性PJW4303/HB(两组小鼠均产生了较强的 CTL 杀伤活性(杀伤率大于 50%);基因枪 组又稍优于肌内注射组。对照质粒 PJW4303 接种后，基因枪组几乎测不出 CT

18、L 活性，肌肉注射组则有低水平非特异性反应。讨论DNA 疫苗作为一种全新的高效免疫方法，已在许多难治性感染性疾病、自 身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出诱人的应用 前景：1。DNA疫苗可刺激机体特异性 CTL 功能的特性给 HBV 慢性持续感染的治 疗带来新的希望。Kuhober 和 Geissler 等6,7作了 HBcAg DNA 疫苗肌内注射法 免疫小鼠的初步观察。本实验同时采用基因枪和肌内注射方法，观察了自行构 建的 HBcAg DNA 疫苗接种后H-2b小鼠的特异性免疫应答。就特异性体液免疫反应而言，基因枪组和肌肉注射组小鼠在接种 PJW4303/HBC后，抗

19、 HBc 终点滴度均达 1 : 10 万以上，经定量检测，两组小鼠 血清抗 HBc 含量均大于 900PEI 单位。Geissler 等 将其构建的 HBcAg DNA 疫 苗用肌内注射法接种小鼠，其血清抗 HBc 含量仅为 56PEI 单位。我们推测本 研究所以获得高滴度的抗 HBc反应，可能是由于 1.所采用的 HBV 核心区基因片 断经 5端修饰而具高效表达能力：3:;2.所选用的载体质粒 pJW4303 是一种哺 乳动物细胞高效表达载体8； 3. 没有采用预先注射肌肉坏死剂的方法，避免 了局部炎症对免疫应答的干扰； 4. 3 次免疫之间的间隔为 4 周，使免疫应答 更为充分。一般认为，

20、机体的 Th1 型免疫反应可促进病原体的清除，而 Th2 型免疫反 应则可加重机体的病理损害：切。Feltquate 等发现，DNA 疫苗经基因枪法接 种后宿主以Th2 型（IgG1 为主）反应多见，而经肌内注射法接种后则 Th1 型 （IgG2a 为主）反应多见。本实验结果与以上报告有同有异。同者是肌肉注射法 接种后表现为 IgG2a 占绝对优势，为典型的 Th1 型反应；异者是本实验中基因 枪法接种后亦以 IgG2a 占优势，倾向于 Th1 型反应。我们认为这种差异可能与 DNA 疫苗中目的基因及其产物的结构与功能、宿主对其产生的免疫反应不尽相 同有关。pJW4303/HBc 能否诱导小鼠

21、产生良好的特异性 CTL 活性，这是本研究的核 心问题所在。结果表明，该 DNA 疫苗无论用基因枪法或肌内注射法接种小鼠 后，在效应细胞：靶细胞=12：1 时，小鼠脾细胞的 HBcAg 特异性 CTL 杀伤率即 达到 50%以上，说明该 DNA 疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生 较强的 CTL 反应。这一结果为我们进一步探索该 DNA 疫苗在治疗主要因机体 CTL 功能低下所致 HBV 慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基 础。本课题受卫生部科学研究基金资助 （编号 961347）作者单位 ：210029 南京医科大学第一附属医院传染病科 （黄祖瑚、刘宁 ）；美 国马萨

22、诸塞大学医学中心 （卢山、王世霞 ）参考文献1Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine. Seminars in Immunology,1997,9:271-283.2Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. AnnRew Immunol, 1995,13;29-60.3叶廷安，詹美云 . 通过乙型肝炎病毒核心基因 5端的修饰使核心抗原在大 肠杆菌中高效表达 .病毒学报， 1988， 4：312-318.4Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al.

23、 DNA vaccines:protective immunizationsby parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. ProcNatl Acad Sci USA, 1993,90:11478-11482.5Kuhober A, Wild J, Pudollek HP, et al. DNA vaccination with plasmid encoding theintracellular (HBcAg) or secreted (HBeAg) form of the core protein of hepatitis B virusprimes T cell responses to two overelapping Kb-and Kd-restricted epitopes.International Immunology, 1997,9:1203-1212.6Kuhober A, Pudollek HP, Reifenberg K, et al. DNA immunization induces antibodyand cytotoxic T