SNP检测方法(讲课版)2

1、1CCR(combined chain reaction ) 2基本步骤1、DNA模板的变性2、引物和单链模板间的退火3、DNA聚合酶(无5- 3外切酶活性) 催化引物延伸4、延伸引物的3端和下游引物5端间的连接。3优点：1.快速简单，仅需DNA 的分离、CCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳检测产物几步2. 产生的产物片段大, 通过琼脂糖凝胶电泳就可实现对产物的检测（不需引物标记等繁琐技术）4 LRCA(ligation-rolling circle amplication）5基本原理与步骤1.通过对挂锁探针(开口的环状探针,padlock probe) 的连接来区分碱基多态性位点,2.利用滚环扩增对

2、信号放大实现检测优点：不需预扩增，同管反应和检测，灵敏度提高（滚环扩增的扩大作用）63）限制性内切酶74）外切酶FEN（Invader assay）8基本步骤和原理1.插入复合物的形成：插入探针和信号探针均和靶DNA模板互补杂交，信号探针的5端和插入探针的3端产生至少一个碱基的重叠,从而产生插入复合物(invasive complex) 结构2.插入复合物被特异性的外切酶FEN 所切割,将信号探针的5端重叠部分切除,5端的切除常和荧光信号的改变相连作为检测的手段,或者也可以用质谱分析来检测。3. 位点出现的错配将大大降低FEN 的切割速率,只能达到正确配对时的1/ 300 ,从而实现对SNP

3、的高效检出9优点：1.只有两个探针与模板完全配对后才可以形成插入复合物的结构,因此其检测结果比简单杂交的准确性好2.FEN的酶切特异性非常高,酶切产物是均一的寡核苷酸,易与其他杂质成分区分,无需电泳3.检测前不用进行PCR预扩增,消除了PCR引入突变导致假阳性的因素。104)Rnase H（UCAN ）11基本原理和步骤1.引物为：DNARNADNA;DRD primer，且3末端被化学基团封阻（RNA内包括SNPs位点）2.若靶DNA和引物中的RNA部分完全匹配,RNase H消化引物RNA 部分而去除了封阻的3末端,使DNA 聚合酶的延伸反应得以进行。反之则不能优点：无需PCR仪等设备、1

4、小时内完成123.以构象为基础的方法以构象为基础的方法n单链构象多态性( single strand conformational polymorphism ,SSCP) n温度梯度凝胶电泳( temperature gradient gel electrophoresis ,TGGE) n变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient ge electrophoresis ,DGGE) n变性高效液相色谱检测 ( denaturing high performance liquid chromatography ，DHPLC)134.直接测序的方法直接测序的方法主要流程是: PC

5、R 扩增目的片段纯化、回收4 种荧光标记(ddNTP) 测序反应过柱去除多余的荧光和引物测序仪上电泳并用测序软件分析。14二、检测分析技术二、检测分析技术1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术 151.凝胶分析技术凝胶分析技术板电泳 毛细管电泳 162.荧光检测技术荧光检测技术n荧光共振能量迁移 ( Fluorescence resonance energy transfer , FRET) n荧光偏振 (Fluorescence polarization , FP) 17FRET(Fluorescence resonance energy transfer）

6、18FP（Fluorescence polarization ）193. DNA 芯片芯片n杂交型芯片 n利用酶的特异性（Minisequencing和Invader assay）204.质谱质谱 (mass spectrometry)检测技术检测技术n基本原理和步骤基本原理和步骤n固相捕获结合单碱基延伸固相捕获结合单碱基延伸 nGOOD 分析法分析法21基本原理和步骤1.质谱分析在样品分子离子化后,根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定分子量，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开。2.样品来源可以是PCR 产物、引物延伸反应、入侵者酶切产物等,通过质谱可直接检测样品或探针的不同质量,推导出样品的SNPs.3.利用质谱分析一个样品只需几秒钟, 具有快速、准确、自动化程度高和高通量等特点.5.主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检测。22固相捕获固相捕获结合结合单碱基延伸单碱基延伸 类似前面的APEX2324“GOOD 分析法” 新的样品准备方法1.在引物延伸反应中,使延伸产物为磷硫骨架（其抗磷酸二酯酶消化），方法：引物3末端碱基有磷硫桥,底物为-S-dNTP。2.然后用磷酸二酯酶消化,除去正常的磷酸骨架,而磷硫骨架抗消化，只剩下延伸的磷硫骨架产物。3