流式细胞仪的原理

1、流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以是以流式细胞仪为检测手段，能够快速、精确流式细胞仪为检测手段，能够快速、精确的对单个细胞或的对单个细胞或颗粒的物颗粒的物理和化学特性理和化学特性（如大小、内部结构、（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、抗原等）抗原等）进行多参数定量分析和分选的技进行多参数定量分析和分选的技术。术。流流 式式 细细 胞胞 术术 的的 特特 点点（1）流式细胞术最大的特点是能在保持）流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器的结构及功能不被破坏的细胞及

2、细胞器的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号对状态下，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞进行定量分析或纯化分选。（2）测量快速、大量、准确、灵敏、定）测量快速、大量、准确、灵敏、定量量流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构细胞大小细胞大小细胞颗粒度细胞颗粒度DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能 细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的核的 特异性抗原特异性抗原 细胞活性细胞活性 细胞内细胞内/外的细胞因子外的细胞因子 激素结合位点激素结合位点 细胞受体细胞受体 钙离子浓度钙离子浓度 线

3、粒体膜电位线粒体膜电位 一、流式细胞仪的工作原理一、流式细胞仪的工作原理n采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；性与激发效率；n利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；保证检测的灵敏度和特异性；n用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。度与统计分析精确性。 1.1.流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的基本结构（1） 液流

4、系统液流系统（2） 光学系统光学系统（3） 数据处理系统数据处理系统（1 1）液）液 流流 系系 统统n 单细胞悬液单细胞悬液n 大多数仪器检测范围是在大多数仪器检测范围是在50-300 50-300 m m 大小。大小。n将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程, ,称为流体动力学聚焦称为流体动力学聚焦液液 流流 系系 统统 示示 意意 图图（2 2）光）光 学学 系系 统统 由激光光源由激光光源、分色反光镜分色反光镜、光束成形光束成形器器、透镜组透镜组、滤片和光电倍增管组成。滤片和光电倍增管组成。FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS

5、 and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector流流 式式 细细 胞胞 仪仪 与与 显显 微微 镜镜 的的 区区 别别区别区别流式细胞仪流式细胞仪光学显微镜光学显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机计算机人工人工结果结果多参数，高通量综合分多参数，高通量综合分析析简单，单参数简单，单参数

6、二、散二、散 射射 光光 的的 测测 量量 细胞在液柱中与激光束相交时向细胞在液柱中与激光束相交时向周围周围360立体角方向散射的光线信立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为胞内颗粒折射等有关，主要分为前向前向散射光散射光和侧向散射光侧向散射光。前前 向向 散散 射射 光（光（FSFS） 前向散射光（前向散射光（forward scatter, FSforward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度度(0.5(0.51010) )向前方散射的讯号用于向前方散

7、射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比与细胞体积大小成正比。 通常在通常在FCM应用中，选取应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。前前 向向 散散 射射 光光 示示 意意 图图FALS SensorLaser前向散射光前向散射光侧侧 向向 散散 射射 光（光（SSSS） 侧向散射光（侧向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射细胞时，光以激光束照射细胞时，光以90

8、90角散射角散射的讯号，用于检测细胞的讯号，用于检测细胞内部结构属性。内部结构属性。侧侧 向向 散散 射射 光光 示示 意意 图图FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光 光光 散散 射射 测测 量量 的的 用用 途途 测得的测得的FS与与SS信号通过计信号通过计算机处理，可得到算机处理，可得到FS-SS图，图，由此可仅用散射光信号对未由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分染色的活细胞进行分析或分选。选。 此为血细胞分类的基本此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。原理，但不能分析表面分子。光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群

9、体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 三、荧三、荧 光光 的的 测测 量量n荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。不同。n每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。管。n选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不

10、同特征。上的多个不同特征。荧荧 光光 染染 料料 的的 特特 性性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)荧荧 光光 信信 号号 的的 检检 测测n使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析n荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧荧 光光 补补 偿偿5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7四、细四、细 胞胞 分分 选选 原原 理理 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对通过流式细胞仪进行细胞

11、分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。行的。细细 胞胞 分分 选选 示示 意意 图图细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电五、数五、数 据据 的的 显显 示示 与与 分分 析析n参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FLn数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点、双参数散点图图 、二维等高图、二维等高图 、假三维等高图、假三

12、维等高图 、三参数、三参数散点图散点图 ）n设门分析技术设门分析技术（一）参（一）参 数数 说说 明明FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少以及荧光种类：反映颗粒被染上的荧光数量多少以及荧光种类（二）（二）数数 据据 显显 示示 方方 式式直分析方图直分析方图n单参数直方图单参数直方图n双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图n三参数直方图三参数直方图n多参数分析多参数分析1.1.单单 参参 数数 直直 方方 图图 由一维参数由一维参数( (散射光或

13、荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。单单 参参 数数 直直 方方 图图细胞相对数细胞相对数量量信道信道(channel(channel ) )2.2.双双 参参 数数 直直 方方 图图n双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。定细胞在图上的表达位置。n双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点通常采用对数信号，最常用的是点密图，在

14、图中，每个点代表一个细胞，点图利密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。数量的多少。双双 参参 数数 直直 方方 图图 点点 图图绿色荧光强绿色荧光强度度红色荧光强红色荧光强度度（三）（三）设设 门门 分分 析析 技技 术术 设置：指根据该图的细胞群分布选定其设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。中想要分析的特定细胞群。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。边形门、任意形状门和十字门。A 淋巴细胞淋巴细

15、胞B 单核细胞单核细胞C 中性粒细胞中性粒细胞A、B、C均为任均为任意门意门线性门线性门 2. 区阈区阈（RegionRegion设置设置）: 如十字门分析时，由四个如十字门分析时，由四个区阈构成，即区阈构成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+（1）淋巴细胞亚群检测： CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的变化监测，AIDS（2）HLA-B27:强直性脊柱炎 （3） 白血病免疫分型：白血病的分类（4） 贫血的鉴定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗体 (5) . 六、流式

16、细胞术的临床应用六、流式细胞术的临床应用七、七、流流 式式 细细 胞胞 仪仪 的的 科科 研研 应应 用用=细胞周期的分析细胞周期的分析=干细胞研究干细胞研究=癌症病人的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究=流式细胞术在免疫检验中的应用流式细胞术在免疫检验中的应用DNA DNA 细细 胞胞 周周 期期 分分 析析Scell divisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)PIPI染色检测细胞周期染色检测细胞周期 ProtocolProtocol n离心收集

17、细胞，弃上清，用离心收集细胞，弃上清，用PBSPBS洗细胞两次。洗细胞两次。n加入预冷的加入预冷的70%70%乙醇，于乙醇，于4 40 0C C固定过夜，或固定过夜，或-20-200 0C C长期固长期固定。定。n细胞染色：离心收集细胞，用细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS1mlPBS洗细胞一次，加洗细胞一次，加入入500ulPBS500ulPBS（含（含50ug/ml50ug/ml溴化乙锭（溴化乙锭（PIPI），），100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)4100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40 0C C避光孵育避光孵育303

18、0分钟。分钟。n流式细胞仪检测：一般细胞计数流式细胞仪检测：一般细胞计数2-32-3万个。结果用软件万个。结果用软件ModfitModfit分析。分析。 细细 胞胞 凋凋 亡亡 的的 检检 测测n细胞形态及细胞膜通透性的变化细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest 33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）nCaspasesCaspases激活激活(Caspase-3 ) n线粒体跨膜电位降低线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123）n膜磷脂酰丝氨酸外化膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI)nCa2+ Ca2+ 浓度升高浓度升高 (Fluo-3）nDNADNA断裂及含量的变化断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI） Annexin-V Annexin-V 和和 PI PI 双双 染染 protocolprotocol n细胞用冷细胞用冷PBSPBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（binding bufferbinding buffer）中以