第二章 核酸分子杂交 - 副本

1、第二章第二章 核酸分子杂交核酸分子杂交 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid hybridization) 技术是分子技术是分子生物学领域中生物学领域中最常用最常用的基本技术之一。的基本技术之一。 其基本原理是两条互补核酸单链其基本原理是两条互补核酸单链DNA或或RNA在一定条件在一定条件下（适宜的温度及离子强度）可按照碱基互补配对的原则下（适宜的温度及离子强度）可按照碱基互补配对的原则退火退火形成双链分子（形成双链分子（DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA)，由此由此可检测特定核酸分子的存在与否可检测特定核酸分子的存在与否。杂交双方是待测的。杂交双方是待测的核酸序列

2、及探针，杂交后形成的双链分子称为杂交分子或核酸序列及探针，杂交后形成的双链分子称为杂交分子或杂交双链。由于是在分子水平上进行的，故称为分子杂交。杂交双链。由于是在分子水平上进行的，故称为分子杂交。Basic PrincipleDenatureHybridizeSouthern, FishPCRProtein: Antigen-antibody interaction lDNA: denaturation and hybridization of the helix structure 核酸分子杂交分为核酸分子杂交分为液相杂交液相杂交、固相杂交固相杂交。液相杂。液相杂交是参加反应的两条核酸单链都

3、游离在液体中。交是参加反应的两条核酸单链都游离在液体中。固相杂交是将参加反应的一条核酸单链先固定在固相杂交是将参加反应的一条核酸单链先固定在固体主持物上，另一条互补核酸单链游离在溶液固体主持物上，另一条互补核酸单链游离在溶液中，两者在一定条件下进行杂交的反应。中，两者在一定条件下进行杂交的反应。 由于核酸分子杂交技术的由于核酸分子杂交技术的高度特异性高度特异性及检测方法及检测方法的的高度灵敏性高度灵敏性，使其在分子生物学领域内被广泛，使其在分子生物学领域内被广泛使用。使用。三、基本实验流程：三、基本实验流程：第二节、核酸探针及其标记第二节、核酸探针及其标记 核酸探针是指标记有核酸探针是指标记有

4、放射性放射性或或其他标记其他标记物物的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样品中特定核苷酸序列。品中特定核苷酸序列。一、探针的种类及其选择一、探针的种类及其选择 核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以是克隆的基因组是克隆的基因组DNA、全长、全长cDNA或部分片段，或部分片段，也可以是也可以是RNA。 应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探针。选择探针时应充分考虑探针的针。选择探针时应充分考虑探针的特异性特异性及其及其来来源是否方便源是否方便等因素。等因素。1.基因组基因

5、组DNA探针探针 克隆化的各种基因片段是最广泛采用的核酸探针。选择此克隆化的各种基因片段是最广泛采用的核酸探针。选择此类探针，要特别注意真核生物基因组中的高度重复序列，类探针，要特别注意真核生物基因组中的高度重复序列，要尽可能选用基因的编码序列作为探针，否则可能会引起要尽可能选用基因的编码序列作为探针，否则可能会引起假阳性结果。因此，真核基因组假阳性结果。因此，真核基因组DNA探针用于探针用于检测基因表检测基因表达达时杂交效率要明显低于时杂交效率要明显低于cDNA探针。探针。 2.cDNA探针探针 提取，经反转录成，经克隆或提取，经反转录成，经克隆或扩增，可制备探针。扩增，可制备探针。 c探针

6、不含内含子及高度重复序列，是一种较为理探针不含内含子及高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。想的核酸探针。因此尤其适用于基因表达的检测因此尤其适用于基因表达的检测。 .探针探针 通常采用含或启动子的表达载体来制备高度敏通常采用含或启动子的表达载体来制备高度敏感的探针。感的探针。 目的基因目的基因克隆到克隆到含或启动子的表达载体的多含或启动子的表达载体的多克隆位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒克隆位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒线性化，加入或聚合酶、和线性化，加入或聚合酶、和，即可以目的基因的为模板，即可以目的基因的为模板，合成高放射性的探针。合成高放射性的探针。 作

7、为探针作为探针较为理想较为理想，但极易被环境中大量存在的核，但极易被环境中大量存在的核酸酶酸酶降解降解，较难于操作，故限制了其使用。，较难于操作，故限制了其使用。.寡核苷酸探针寡核苷酸探针 随着合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸随着合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸片段作为探针也非常普遍。片段作为探针也非常普遍。 研究者可根据已知的基因序列或根据氨基酸序列推测出的研究者可根据已知的基因序列或根据氨基酸序列推测出的序列，合成一段的寡核苷酸片段。序列，合成一段的寡核苷酸片段。DNA探针（包括探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：探针）的主要优点有下面三点：这类探针多克隆在质粒载

8、体中，可以无限繁殖，取之不尽，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。制备方法简便。DNA探针不易降解（相对探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制而言），一般能有效抑制DNA酶活性。酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非标记法等，能用于同位素和非同位素标记。同位素标记。 克隆探针的优缺点：克隆探针的优缺点：（1）克隆探针一般较寡核苷酸探针）克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强特异性强，复杂度也高，从统计学，复杂度也高，从统计

9、学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，（2）克隆探针的另一优点是，可获得）克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号较强的杂交信号，因为克隆探针，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。（3）但是，较长的探针）但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于。对于仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列，克隆探针不能区分，往往杂仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。这既是其优点，又是其缺点。优点是当用于

10、检测病原微交信号相当。这既是其优点，又是其缺点。优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是的少许变异而漏诊，缺点则是不能用不能用于点突变的检测于点突变的检测。这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。 合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点： 由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，的时间比克隆探针短，如如20nt的寡核苷酸探针在浓度为的寡核苷酸探针在

11、浓度为100ng/ml，靶序列为靶序列为1100pg、1kb片段或片段或310-18310-16mol/L时，达到最时，达到最大程度的杂交只需大程度的杂交只需10min，而用，而用2kb的克隆探针在同样条件下达到完的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需全杂交则需16h。 寡核苷酸探针可识别靶序列内寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，个碱基的变化，因为短探针中碱基的因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。值。 一次可大量合成寡核苷酸探针（一次可大量合成寡核苷酸探针（110mg），使得这种探针价格低廉，），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探

12、针能够用酶学或化学方法修饰以进行非与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（或选择相对长的序列（30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有针。最常用的寡核苷酸探针有1840个碱基，目前的合成仪可有效个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少地合成至少50个碱基的探针。个碱基的探针。二、核酸标记物及其选择二、核酸标记物及其选择 为了便于示踪检测，探针必须采用一定方法加以标记，以为了便于示踪

13、检测，探针必须采用一定方法加以标记，以利于杂交结果的显示。利于杂交结果的显示。 一种理想的核酸探针标记物应该具备：一种理想的核酸探针标记物应该具备：.高度灵敏性，高度灵敏性，.高度特异性，且标记物与核酸探针结合后应不能影响高度特异性，且标记物与核酸探针结合后应不能影响探针与模板的结合能力及特异性。探针与模板的结合能力及特异性。.当用酶促方法进行当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性无影响；标记时，应对酶促活性无影响；.较高的化学稳定性，较高的化学稳定性，保存时间长。保存时间长。.标记及检测方法简单，标记及检测方法简单，.对环境无污染，对环境无污染，对人体无损伤等。对人体无损伤等。 常见的标记物有

14、常见的标记物有放射性核素放射性核素、生物素、地高辛生物素、地高辛和和荧光素荧光素等。等。（一）放射性核素（一）放射性核素 是一类灵敏度极高、特异性极高的标记物。适宜的条件下是一类灵敏度极高、特异性极高的标记物。适宜的条件下可检测出少于个分子的核酸。可检测出少于个分子的核酸。 且不影响各种酶促反应、碱基配对的特异性、稳定性和杂且不影响各种酶促反应、碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。交性质。 其缺点是存在放射性污染，且半衰期短，不能长期存放。其缺点是存在放射性污染，且半衰期短，不能长期存放。 目前常用的放射性核素标记物有目前常用的放射性核素标记物有、。. 释放的释放的粒子能量高、穿透性较强等放射

15、性强的特点，放射自显影所粒子能量高、穿透性较强等放射性强的特点，放射自显影所需时间短，需时间短，灵敏度高灵敏度高。缺点是。缺点是半衰期短半衰期短（.天），天），散射严重散射严重，有时会导致显影条带轮廓不清。有时会导致显影条带轮廓不清。适用于各种膜的杂交，适合于检测基因组中的单拷贝基因。商品化的适用于各种膜的杂交，适合于检测基因组中的单拷贝基因。商品化的主要是标记的各种和。其保存形式主要有水溶主要是标记的各种和。其保存形式主要有水溶液和乙醇：水（：）溶液两种。前者可直接使用，或者使用前必液和乙醇：水（：）溶液两种。前者可直接使用，或者使用前必须进行浓缩干燥。须进行浓缩干燥。. 释放的释放的粒子能

16、量较低、粒子能量较低、检测灵敏度较检测灵敏度较稍低稍低，但也基本达到检测，但也基本达到检测基因组中单拷贝基因的要求。基因组中单拷贝基因的要求。散射较弱散射较弱，显影条带轮廓分辨率较高。，显影条带轮廓分辨率较高。半衰期较半衰期较长长（87.1天）。越来越受到研究者的青睐。天）。越来越受到研究者的青睐。. 释放的释放的粒子能量极低，粒子能量极低，散射极少散射极少，显影条带轮廓分辨率最高，且本，显影条带轮廓分辨率最高，且本底最低，最适于细胞原位杂交。底最低，最适于细胞原位杂交。半衰期长半衰期长（12.3年），可长时间存放。年），可长时间存放。但自显影所需时间较长但自显影所需时间较长。（二）非放射性标

17、记物（二）非放射性标记物 优点：优点：.安全，无污染。安全，无污染。.稳定性好，可长期稳定性好，可长期存放，批次检测间重复性好。存放，批次检测间重复性好。.利用不同探针标利用不同探针标记方法，可一次对同一样品进行多探针杂交。记方法，可一次对同一样品进行多探针杂交。 缺点：灵敏度、特异性有时不太理想。缺点：灵敏度、特异性有时不太理想。 主要包括三类，半抗原类、荧光素类、酶类。半主要包括三类，半抗原类、荧光素类、酶类。半抗原类使用最广泛。抗原类使用最广泛。.半抗原：半抗原：有生物素、地高辛、二硝基苯、雌二醇等。前两有生物素、地高辛、二硝基苯、雌二醇等。前两者使用最广泛，均有商品化试剂盒。者使用最广

18、泛，均有商品化试剂盒。（）生物素（）生物素通过连接臂与或的嘧啶环第位通过连接臂与或的嘧啶环第位相连，修饰后的或可代替相连，修饰后的或可代替参入到标记的核酸探针中。参入到标记的核酸探针中。通过偶联有荧光素或特定的酶如或的通过偶联有荧光素或特定的酶如或的抗生物素抗体来检测。抗生物素抗体来检测。但生物素是一种维生素分子，普遍存在于各种细但生物素是一种维生素分子，普遍存在于各种细胞中，因而原位杂交时内源性背景较大。胞中，因而原位杂交时内源性背景较大。（）地高辛（）地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒苷，来源于植物毛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒苷，来源于植物毛花洋地

19、黄，是应用广泛的一种非放射性标记物。通过偶联有荧光素或特定花洋地黄，是应用广泛的一种非放射性标记物。通过偶联有荧光素或特定的酶如或的地高辛抗体来检测。一般生物体中不存在，消除了的酶如或的地高辛抗体来检测。一般生物体中不存在，消除了内源性背景的问题。在原位杂交中，效率更高，且有灵敏的检测体系，灵内源性背景的问题。在原位杂交中，效率更高，且有灵敏的检测体系，灵敏度在原位杂交中倍于生物素系统。敏度在原位杂交中倍于生物素系统。探针非常稳定，度下可保存数年。探针非常稳定，度下可保存数年。. 荧光素类荧光素类主要包括主要包括异硫氰酸荧光素（）、罗丹明异硫氰酸荧光素（）、罗丹明等。等。通过酶促反应将荧光素化

20、的参入探针分子，杂交后可直接在荧光显通过酶促反应将荧光素化的参入探针分子，杂交后可直接在荧光显微镜下观察结果。利用不同颜色荧光素标记的探针可进行多重原位杂交，同微镜下观察结果。利用不同颜色荧光素标记的探针可进行多重原位杂交，同时检测多个基因。时检测多个基因。荧光探针多用于染色体、基因芯片、细胞、切片标本的检测。荧光探针多用于染色体、基因芯片、细胞、切片标本的检测。该方法简单快该方法简单快捷，但没有放大过程，捷，但没有放大过程，灵敏度较低灵敏度较低，仅适用于高拷贝基因序列。且荧光强度，仅适用于高拷贝基因序列。且荧光强度随着激发光照射时间的增加而衰退。也可作为半抗原标记。用酶连抗荧光素随着激发光照

21、射时间的增加而衰退。也可作为半抗原标记。用酶连抗荧光素的抗体。其灵敏度高于前者。的抗体。其灵敏度高于前者。. 酶酶这类标记物以增强化学荧光法（）系统为代表。将、与寡这类标记物以增强化学荧光法（）系统为代表。将、与寡核苷酸探针直接共价相连。然后检测。核苷酸探针直接共价相连。然后检测。此法简化了检测步骤，减少了非特异性污染的可能，灵敏度高。此法简化了检测步骤，减少了非特异性污染的可能，灵敏度高。但由于酶本身是蛋白质分子，易变性，因而在其后的操作中不能采用剧烈的但由于酶本身是蛋白质分子，易变性，因而在其后的操作中不能采用剧烈的条件（如温度不超过度，不能使用强酸、碱、去垢剂，离子强度也要适条件（如温度

22、不超过度，不能使用强酸、碱、去垢剂，离子强度也要适中等），因此要注意其非特异性背景的问题。中等），因此要注意其非特异性背景的问题。在这些系统中以新的荧光色素类标记物最有潜力。在这些系统中以新的荧光色素类标记物最有潜力。三、核酸探针的标记方法三、核酸探针的标记方法 .切口平移法标记探针切口平移法标记探针 .随机引物法标记探针随机引物法标记探针 .探针的末端标记探针的末端标记 .探针的标记探针的标记 .探针的标记探针的标记 .寡核苷酸探针的标记寡核苷酸探针的标记3.DNA探针的末端标记探针的末端标记 只对只对DNA的的末端末端进行部分标记，所以标记的进行部分标记，所以标记的活性活性不高不高，一般极

23、少用来做核酸分子杂交探针的标记，一般极少用来做核酸分子杂交探针的标记，主要用于主要用于DNA序列测定等方法所需片段的标记。序列测定等方法所需片段的标记。 多种酶如多种酶如T4DNA聚合酶、聚合酶、T4多核苷酸激酶、末端多核苷酸激酶、末端脱氧核苷酸转移酶和脱氧核苷酸转移酶和DNA聚合酶聚合酶I Klenow片段等片段等均可用于探针的末端标记。均可用于探针的末端标记。 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTPs dNTP标记的标记的dNTPs -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3

24、 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 第三节第三节 Southern 印迹杂交印迹杂交 DNA印迹杂交由英国爱丁堡大学印迹杂交由英国爱丁堡大学Southern EM于于1975年年首先设计应用，故此得名。首先设计应用，故此得名。 是指将通过凝胶电泳分离的是指将通过凝胶电泳分离的DNA片段转移到特定的固相支片段转移到特定的固相支持物上，在转移过程中持物上，在转移过程中DNA分子保持其原来的相对位置不分子保持其原来的相对位置不变，然后采用标记的核酸探针与结合在固相支持物上的变，然后采用标记的核酸探针与结合在固相支持物上的DNA分子进行杂交的技术。分子进行杂交的技术。

25、探针分子显示的位置及量的多少，探针分子显示的位置及量的多少，将反映出待测核酸分子将反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因以及片段大小和量的多少。中是否存在相应的基因以及片段大小和量的多少。 该技术可用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组中基因的该技术可用于克隆基因的酶切图谱分析、基因组中基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析等。分析等。（Edwin Mellor Southern UK） Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、D

26、NA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）一、技术简介一、技术简介一、固相支持物与印迹方法的选择一、固相支持物与印迹方法的选择良好的固相支持物与有效的转移方法是杂交技术成败的两个关键因素。良好的固相支持物与有效的转移方法是杂交技术成败的两个关键因素。（一）固相支持物的选择（一）固相支持物的选

27、择良好的固相支持物应该具备以下几点：良好的固相支持物应该具备以下几点：1.较强的核酸分子结合能力；较强的核酸分子结合能力；2.与核酸分子结合后，不影响其与探针分子的杂交与核酸分子结合后，不影响其与探针分子的杂交反应；反应；3.与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落；落；4.在洗膜条件下能将非特异吸附在其表面的核酸分子洗脱；在洗膜条件下能将非特异吸附在其表面的核酸分子洗脱；5.具有良好的柔具有良好的柔韧性等机械性能，便于操作。韧性等机械性能，便于操作。目前实验室常用的膜固相支持物有目前实验室常用的膜固相支持物

28、有硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜和和尼龙膜尼龙膜。硝酸纤维素膜早期应用广泛。主要依靠硝酸纤维素膜早期应用广泛。主要依靠疏水作用疏水作用结合核酸分子，因而结合核酸分子，因而结合不太牢结合不太牢固固，且质地，且质地较脆较脆，操作需特别小心，很难进行多轮杂交。与核酸结合需要高离子，操作需特别小心，很难进行多轮杂交。与核酸结合需要高离子强度，不适于用碱性溶液进行转移。强度，不适于用碱性溶液进行转移。尼龙膜是目前比较理想的一种固相支持物，有普通尼龙膜与带正电荷的尼龙膜。尼龙膜是目前比较理想的一种固相支持物，有普通尼龙膜与带正电荷的尼龙膜。带正电荷尼龙膜结合核酸的能力更强，灵敏度更高，但价格比较昂贵，普通尼龙带

29、正电荷尼龙膜结合核酸的能力更强，灵敏度更高，但价格比较昂贵，普通尼龙膜可以满足一般的杂交实验要求。核酸分子膜可以满足一般的杂交实验要求。核酸分子共价结合共价结合在尼龙膜上，因此结合牢固。在尼龙膜上，因此结合牢固。结合核酸的条件没有硝酸纤维素膜那么严格，在酸性、碱性、中性、高或低离子结合核酸的条件没有硝酸纤维素膜那么严格，在酸性、碱性、中性、高或低离子强度均可。强度均可。且韧性强且韧性强，操作方便，可进行多轮杂交。其，操作方便，可进行多轮杂交。其缺点是杂交信号本底较高。缺点是杂交信号本底较高。此外，聚偏二氟乙烯膜（此外，聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）在用非放射性核素标记物标记的探针进行杂膜）在用非

30、放射性核素标记物标记的探针进行杂交中常用。具有较高的强度，但背景较高。交中常用。具有较高的强度，但背景较高。（二）印迹方法的选择（二）印迹方法的选择目前常用的转移方法有目前常用的转移方法有毛细管转移、电转移、真空转移毛细管转移、电转移、真空转移三种。三种。技术初期主要采用毛细管转移法。利用技术初期主要采用毛细管转移法。利用毛细管虹吸作用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上。操作简单，重复性好，不需要特殊设备，目前酸分子转移到固相支持物上。操作简单，重复性好，不需要特殊设备，目前仍是实验室最常采用的转移方法之一。仍是实验室最常采用的转移方法之一。电转移法是电

31、转移法是利用电场的作用利用电场的作用将凝胶中的核酸分子转移到杂交膜上，是一种简将凝胶中的核酸分子转移到杂交膜上，是一种简单、迅速、高效的核酸转移法。电转移法对于不适于毛细管转移的聚丙烯酰单、迅速、高效的核酸转移法。电转移法对于不适于毛细管转移的聚丙烯酰胺凝胶中的核酸以及大片段核酸的转移更为适用。根据装置不同分为两种：胺凝胶中的核酸以及大片段核酸的转移更为适用。根据装置不同分为两种：湿式电转法和干式电转法。在电转过程中，一般选用尼龙膜，因硝酸纤维素湿式电转法和干式电转法。在电转过程中，一般选用尼龙膜，因硝酸纤维素膜需要的高离子强度缓冲液将会影响电转效率。膜需要的高离子强度缓冲液将会影响电转效率。

32、真空转移法是又一种简单、迅速、高效的核酸转移法。真空转移法是又一种简单、迅速、高效的核酸转移法。Southern HybridizationSouthern hybridization has many steps and usually requires more than one day (or lab period) to complete. This procedure can be broken down into several sectionsPreparing the gelThe Southern gel, showing all the DNA bands from cle

33、aving Lambda with different restriction enzymes. Since we know the sequence that is complimentary to our probe, we should be able to determine which fragment will be detected by the probe Northern blot：是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。第五节第五节 其他核酸分子杂交其他核酸分子杂交一、斑点杂交与狭缝杂交一、斑点杂交与狭缝杂交将将RNA或或DNA变性后变性后直接点样于直接点样于硝

34、酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交，这种杂交方法称之为点杂交（特定的探针进行杂交，这种杂交方法称之为点杂交（dot blotting）；）；若采用狭缝点样器加样后杂交，则称为狭缝杂交（若采用狭缝点样器加样后杂交，则称为狭缝杂交（slot blotting），），二者的区别主要是点样的形状不同。二者的区别主要是点样的形状不同。该方法常用于基因表达的该方法常用于基因表达的定性及定量分析定性及定量分析，是实验室中的常用技术。，是实验室中的常用技术。对于分级筛选或从高丰度的对于分级筛选或从高丰度的mRNA库中识别目的基因，每个点上有库中识别目的基因，每个点上有

35、5g总总RNA就足够了；而对于中、底丰度的转录本，必须加更多的总就足够了；而对于中、底丰度的转录本，必须加更多的总RNA。有时为了更有效低检测基因的转录本，应采用纯化的。有时为了更有效低检测基因的转录本，应采用纯化的mRNA。点杂交的优点是点杂交的优点是简单、迅速简单、迅速，可在同一张膜上同时进行，可在同一张膜上同时进行多个样品多个样品的检的检测，对于核酸粗提样品的检测效果较好；缺点是测，对于核酸粗提样品的检测效果较好；缺点是不能鉴定不能鉴定所测基因的所测基因的分子量分子量，而且特异性不高，有一定比例的，而且特异性不高，有一定比例的假阳性。假阳性。 喉不同病变组织中HPV DNA斑点杂交结果-

36、人喉癌组织中人乳头瘤病毒DNA检测. MBLL cDNA的克隆及组织表达分析的克隆及组织表达分析 。利用Northern和RNA斑点杂交检测MBLL基因在43种成人组织，7种胎儿组织中的表达，结果显示MBLL是一个广泛表达的基因，但是表达量在不同组织中有差异. 狭缝杂交检测10ngml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-2、bax表达水平的改变 蛋白mrna狭缝杂交狭缝杂交结果 二、原位杂交二、原位杂交核酸原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与核酸原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片细菌、细胞或组织切片中中的的核酸核酸进行杂交，从而在显微水平检测出进行杂交，从而在

37、显微水平检测出目标基因或转录产物在细胞内的位目标基因或转录产物在细胞内的位置及数量置及数量。主要包括用于基因克隆筛选的主要包括用于基因克隆筛选的菌落原位杂交菌落原位杂交、检测、检测基因在细胞内的表达与定基因在细胞内的表达与定位的原位杂交位的原位杂交以及基因在染色体上定位的以及基因在染色体上定位的染色体原位杂交染色体原位杂交等。等。（一）菌落原位杂交（一）菌落原位杂交菌落原位杂交技术主要用于菌落原位杂交技术主要用于基因克隆以及基因文库的筛选基因克隆以及基因文库的筛选，以期从大量细菌，以期从大量细菌克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆。克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆。将板上生长的菌落印迹到膜

38、上，标记相对位置。用碱变性方法对菌落进行裂将板上生长的菌落印迹到膜上，标记相对位置。用碱变性方法对菌落进行裂解。真空解。真空80度烘烤度烘烤2h使使DNA样品固定在膜上。探针的标记、预杂交、杂交、样品固定在膜上。探针的标记、预杂交、杂交、洗膜以及探针的检测方法等均与洗膜以及探针的检测方法等均与Southern杂交方法一致。如噬菌斑原位杂交杂交方法一致。如噬菌斑原位杂交至今仍为从噬菌体文库中筛选重组子的一项最为常用的技术。至今仍为从噬菌体文库中筛选重组子的一项最为常用的技术。（二）荧光原位杂交（二）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH），是

39、一种重要的非），是一种重要的非放射性原位杂交技术，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律放射性原位杂交技术，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律以及病原微生物的检测等，都有重要意义。以及病原微生物的检测等，都有重要意义。原理原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或如果被检测的染色体或DNA纤维纤维切片上的靶切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火退火-复性，即

40、可形成靶复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核核苷酸苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光荧光检测体系在镜下对待检测体系在镜下对待测测DNA进行进行定性、定量或相对定位分析定性、定量或相对定位分析。 实验流程：实验流程：FISH样本的制备样本的制备探针的制备探针的制备探针标记探针标记杂交杂交（染色体显带）（染色体显带）荧光荧光显微镜显微镜检测检测结果分析结果分析 FISH技术的

41、优点：技术的优点：1.荧光试剂和探针经济、安全；荧光试剂和探针经济、安全；2.探针探针稳定，一次标记后可在两年内使用；稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验周期短、能迅实验周期短、能迅速得到结果，特异性好，定位准确；速得到结果，特异性好，定位准确；4.可定位长度在可定位长度在1kb的的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色多色FISH可同时检测多种序列；可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。的结构。 缺点是

42、不能达到缺点是不能达到100%杂交，特别是在应用较短的杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。探针时效率明显下降。 应用：该技术不但可用于已知应用：该技术不但可用于已知基因基因或序列的或序列的染色体定位染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体染色体畸变畸变的研究。的研究。在在基因定性、定量、整合、表达基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。等方面的研究中颇具优势。 FISH Fluorescent In Situ Hybridization 荧光原位杂交荧光原位杂交探针DNA加入荧光标记解螺旋，杂交FISH1616例如左图:通

43、过使用painting 探针（针对16号染色体)，可以确认16号染色体的一段易位到了9号染色体。 使用使用Vysis AneuVysion探针组对探针组对13, 18, 21, X, Y 染色体进行杂交染色体进行杂交普通图像普通图像 分类色图像分类色图像5号染色体上杂交了7种探针，这些探针在位置上分别有部分重叠。18 条带7 条带原始图像DAPI图像实例实例: X / Y 着丝点探针着丝点探针单个或多个全染色体（WCP) 探针探测缺失 探测易位bcr / abl杂交到有爪蟾蜍染色体上的卫星探针(SAT1) Multi- color ISH4505005506006507007500200040

44、00600080001000012000140001600018000200002200024000260002800030000 TMB DAB NFOptical DensityWavelength (nm)TMB - chr. 1DAB - chr. 15NF - chr. 7Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI)多色原位杂交2.abc人类频谱染色体组型分析ace4 .bd频谱 FISHab8 .111 51 51 57多色原位杂交 全菌（采用EUB MIX型探针）亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针） 原位杂交组织化学技术的发展 19

45、61年，Hall 液相核酸杂交技术 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工

46、作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。 Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，

47、从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DNA探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。 上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结

48、臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。

49、地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。原位杂交组织化学技术的基本步骤 大致可分为：杂交前准备，包括取材、固定、切片，玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交后处理；显示（visualization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。 ISHH对照试验一览表核乳胶或非放射性检测系统对照试验Northern 或Southern印迹杂交法ISHH与免疫细胞化学结合应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收试验）与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验）将切片应用R

50、NA酶或DNA酶进行预处理后杂交应用同义RNA探针（Sense probe）进行杂交以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验）组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行ISHH对照应用未标记探针做ISHH，进行对照从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少34种用以证实ISHH结果的可靠性。比较可靠的对照试验:Northern 和Southern印迹杂交法。用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISH

51、H技术证明丢失的是DNA或RNA。 如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。由于同义RNA探针和组织内mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。ISHH的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。应用高敏感度的放射性标记cRNA探针在理想的ISHH的实验条件下检测mRNA，其敏感度可达到20个mRNA拷贝/每个细胞。由于双链DNA的稳定性，在用ISHH定位DNA时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染

52、色体铺片，长于2kb的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。正因为如此，对ISHH结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。因为如前所述，影响ISHH实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中mRNA的降解而导致假阴性结果。另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各异。这些诸多因素都将影响ISHH的实验结果。 成年大鼠海马、齿状回DAT1mRNA阳性神经元 大鼠杏仁外侧核DAT1 mRNA阳性神经元 A 大鼠舌下神经核(12)DAT1 mRNA 阳性神经元 100B 大鼠延髓中央网状核DAT1 mRNA 阳性神经元 200 原位杂交的优点：原位杂交的优点： 组织细胞不需要制成匀浆，不必进行组织细胞不需要制成匀浆，不必进行DNA或或RNA的提取。的提取。 灵敏度好，含量较少的核酸不会在提取的灵敏度好，含量较少的核酸不会在提取的过程中被稀释。过程中被稀释