ELISA检测乙肝抗体

1、ELISA检测乙肝抗体 专业：麻醉K-1 姓名：李凯鹏 学号：1420550146实验目的1.掌握ELISA的原理和操作方。2.熟悉酶标准仪的使用方法。实验原理 【基本原理】 1、抗原或抗体吸附到固相载体的表面，仍保持其免疫活性。 2、抗体或抗原与酶相结合所形成的免疫复合物既保持其免疫活性同时又保持酶的催化活性。 3、酶结合物与相应的抗体或抗原反应后，在遇到相应的底物时，可催化底物水解，氧化或还原，从而产生有色的物质。 反应显色的深浅与相应的抗体或抗原量呈比例关系，抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与酶链接后，仞 保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物时，在酶的催化作用下底物水解显色

2、。产物的量与标本中受检测物质的量直接相关，故跟据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。(三)试剂器材 1.试剂 (1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO1.59克 NaHCO 2.93克 加蒸馏水至1000ml (2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO12H2O2.9克 NaCl8.0克 KCl0.2克 Tween-200.050.5ml 加蒸馏水至1000ml (3)稀释液： 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成510使用。 (4)终止液(2MHSO）： 蒸馏水1

3、78.3ml，逐滴加入浓硫酸(98)21.7ml。 (5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 0.2M NaHPO(28.4克L) 25.7ml 0.1Ma 柠檬酸(19.2克L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。 方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔

4、)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分钟。 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二用于检测未知抗

5、体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml， 每孔加0.1ml，4过夜。次日洗涤3次。 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml， 37孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次

6、3分钟。(简称洗涤，下同)。 2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分钟。 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检

7、测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 注意事项1样品稀释 一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。2试剂盒平衡 Elisa中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25)，一般需在室温放置2030分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37温箱20分钟。 3样品和试剂的混匀 在稀释前、后的样品必须

8、充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。 4加样 加样是一项很重要的步骤。加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。5温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。6洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。 7显色 显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可