DHPLC筛查中国人G6PD基因常见突变

1、DHPLCDHPLC筛查中国人常见筛查中国人常见G6PDG6PD基因突变型基因突变型技术平台的构建技术平台的构建中山大学基础医学院中山大学基础医学院医学遗传学教研室医学遗传学教研室 蒋玮莹蒋玮莹G6PD缺乏症研究现状缺乏症研究现状v 临床临床v 基础科研基础科研一、临床一、临床v发病率高v临床表现v可预防v与其它疾病的关系目前的产前筛查目前的产前筛查生化方法为主生化方法为主 女性杂合子漏诊女性杂合子漏诊基因诊断基因诊断 经典的方法不适合经典的方法不适合 新方法G6PD缺乏症研究现状缺乏症研究现状v 临床临床v 基础科研基础科研二、基础科研 G6PDG6PD基因在国内外一直是研究热点基因在国内外

2、一直是研究热点v国外国外 SNPs SNPs 单体型域单体型域人类基因组进化人类基因组进化优势选择效应优势选择效应v国内国内 集中于致病突变的检测集中于致病突变的检测 SNPsSNPs和单体型方面欠缺和单体型方面欠缺G6PD缺乏症研究现状缺乏症研究现状v 临床临床v 基础科研基础科研新方法新方法突破口 新方法的选择新方法的选择v 变性高效液相色谱分析变性高效液相色谱分析( (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) ) 研究目标研究目标v 构建构建DHPLCDHPLC筛查中国人筛查中国人G6PDG6PD常见基因突变型常见

3、基因突变型的技术平台的技术平台研究方法研究方法 （一）、基因序列数据提取和引物设计（一）、基因序列数据提取和引物设计 调取数据库调取数据库GenBankGenBank中的中的X55448X55448和和UCSC GenomeUCSC Genome Browser Browser中的中的X03674X03674，做为人类做为人类G6PDG6PD基因参考基因参考 序列。序列。PCRPCRDHPLCDHPLC（二）、 操作步骤：（三）、（三）、DHPLCDHPLC分析分析 实实 验验 流流 程程 图图（四）、（四）、DNADNA序列测定进行质量控制序列测定进行质量控制 对于对于DHPLCDHPLC检

4、测后出现色谱峰型异常者，检测后出现色谱峰型异常者，PCRPCR扩增产物进行双向扩增产物进行双向DNADNA测序，应用测序，应用ChromasChromas和和ClustalxClustalx将测序结果与数据库中的序列资将测序结果与数据库中的序列资料进行比对分析。料进行比对分析。 实验结果及讨论实验结果及讨论建立了筛查中国人常见建立了筛查中国人常见G6PD变异型的图片变异型的图片库库建立了筛查中国人常见的建立了筛查中国人常见的G6PD变异型的策变异型的策略略建立了筛查中国人常见的建立了筛查中国人常见的G6PD变异型的技变异型的技术平台术平台评价评价Fig1. Screening for G6PD

5、 gene c.1388 GAFig2. Screening for G6PD gene c.1376 GTFig3. Screening for G6PD gene c.1311 CT and c.1503 TCFig4.Screening for G6PD genec.95AGFig6.Screening for G6PD genec.392 GTFig5.Screening for G6PD genec. 1024 CTFig7. Screening for G6PD gene c.871 GA 根据本课题组十几年来对根据本课题组十几年来对10041004例例G6PDG6PD缺乏症病人缺

6、乏症病人的检测确定筛查步骤。数据显示：的检测确定筛查步骤。数据显示：13761376和和13881388两种突两种突变占所有突变型的变占所有突变型的50%50%以上；加以上；加9595突变后可达到突变后可达到70%70%以以上；若再综合上；若再综合392392和和10241024突变则可达到突变则可达到90%90%以上。以上。 根据突变频率的高低来确定筛查的先后顺序可以根据突变频率的高低来确定筛查的先后顺序可以有效地提高检测效率。有效地提高检测效率。DHPLCDHPLC筛查中国人筛查中国人G6PDG6PD基因常见突变型的策略基因常见突变型的策略待检样本待检样本DHPLCEXON11-12DHP

7、LCEXON11-12 阳阳 性性 阳阳 性性 阳阳 性性 阴阴 性性 阴阴 性性 DHPLCEXON2DHPLCEXON2 阴阴 性性DHPLCEXON5DHPLCEXON5，EXON9EXON9 DHPLCDHPLC其余外显子其余外显子 参照参照DHPLCDHPLC图形数据库确定突变型图形数据库确定突变型测序验证突变型测序验证突变型 Fig.中国人群G6PD常见基因突变型DHPLC筛查策略 A A、灵敏性和特异性：灵敏性和特异性：95%95%以上以上B B、省时、自动化省时、自动化 DHPLC DHPLC筛查一个标本只需筛查一个标本只需8.88.8分钟，并可分钟，并可以自动、连续以自动、连续2424小时运行，适合大规模