生物必修三-动植物细胞工程

1、生物必修三生物必修三动动植植物细胞工程物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞培养、 动物细胞核移植、动物细胞核移植、动物细胞融合、动物细胞融合、 单克隆抗体单克隆抗体动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。提问：提问：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物组织培养, 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞工程植物细胞工程 在在无菌和人工控制的条件下，将离体无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工的植物器官、组织、细胞，培养在人

2、工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。完整的植株。细胞的全能性细胞的全能性1、概念、概念：生物体的细胞具有使后代细胞形成：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性，叫做细胞的完整个体的潜能的特性，叫做细胞的全能性。全能性。2、原因、原因：从理论上讲，每个细胞都包含该物从理论上讲，每个细胞都包含该物种的全部遗传物质（全部基因），所种的全部遗传物质（全部基因），所以每个活细胞都应具有全能性以每个活细胞都应具有全能性 。3、实现条件：、实现条件： 离离体、提供营养物质、激素及

3、其他适宜条件。体、提供营养物质、激素及其他适宜条件。 4 、全能性的比较、全能性的比较 受受精卵精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞 植植物细胞动物细胞物细胞动物细胞切取切取形成层形成层无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽再分化再分化脱分化脱分化植植物组织培养技术物组织培养技术（1）外）外植体：用于离体培养的植物器官或组植体：用于离体培养的植物器官或组织片段织片段。（2）愈）愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。（3）脱）脱分化

4、：分化：由高度分化的植物器官、组织由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。或细胞产生愈伤组织的过程。（4）再）再分化：脱分化产生的愈伤组织重新分分化：脱分化产生的愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程化成根或芽等器官的过程。影影响植物组织培养的因素：响植物组织培养的因素：PI33（1）植物材料的选择：直接关系到实验的成）植物材料的选择：直接关系到实验的成败。败。（2）营养因素营养因素：需要配制适宜的培养基，保：需要配制适宜的培养基，保证营养的供应，常用证营养的供应，常用MS培养基。培养基。（3）使用激素进行调节：使用激素进行调节：生长素和细胞分裂生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分

5、化和再分化的关键素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。要注意激素的浓度、使用的先后顺性激素。要注意激素的浓度、使用的先后顺序及用量的比例。序及用量的比例。（4）环境条件的控制：注意控制）环境条件的控制：注意控制pH、温度、温度、光照等光照等外界条件外界条件。 MS培养基培养基： （1）大量元素：）大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg； （2）微量元素：）微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I； （3）有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素及）有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素及蔗糖等。蔗糖等。 微微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需量元素和大量元素提供植物细胞

6、生活所必需的无机盐；的无机盐； 蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压； 甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。的特殊营养需求。 植物激素调节植物激素调节： （1）在）在生长素存在的情况下，细胞分裂素的生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势；作用呈现加强的趋势； （2）使）使用顺序影响实验结果：用顺序影响实验结果： （3）激）激素用量的比例影响实验结果：素用量的比例影响实验结果： 生长素用量比细胞分裂素用量

7、，比值高时，有利于根的分生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化，抑制根化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化，抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的生长。的形成；比值适中时，促进愈伤组织的生长。植植物组织培养的实验操作物组织培养的实验操作（1）制备制备MS固体培养基固体培养基：（2）外植体消毒外植体消毒：（3）接种：）接种：将外植体插入锥形瓶的培养基中，注意消毒和用封口将外植体插入锥形瓶的培养基中，注意消毒和用封口膜扎好。膜扎好。（4）培养：）培养：将锥形瓶最好放在无菌箱中培养，注意定期消毒，控将锥形瓶最好放在无菌箱中培养，注意定期消

8、毒，控制适宜温度，适时光照。制适宜温度，适时光照。（5）移栽：）移栽：将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活，将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活，长壮后再移栽到土壤中。长壮后再移栽到土壤中。（6）栽培：）栽培：对移栽幼苗适时浇水、施肥，并观察生长情况。对移栽幼苗适时浇水、施肥，并观察生长情况。（7）结果分析与评价：结果分析与评价： 制备制备MS固体培养基固体培养基： （1）配制各种母液：大量元素浓缩）配制各种母液：大量元素浓缩10倍，微倍，微量元素浓缩量元素浓缩100倍；激素类等按倍；激素类等按1mg/Ml质量浓质量浓度单独配制成母液。度单独配制成母液。 （2）配制培养基：

9、按比例配制各种所需成分，）配制培养基：按比例配制各种所需成分，依需要决定是否加入植物激素；依需要决定是否加入植物激素； （3）灭菌：将培养基连同其他器械一起进行）灭菌：将培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。 外植体消毒外植体消毒：依下列顺序进行消毒：依下列顺序进行消毒： 流水冲洗流水冲洗洗衣粉洗洗衣粉洗流水冲洗流水冲洗无菌吸水纸无菌吸水纸吸干吸干70%酒精酒精无菌水冲洗无菌水冲洗无菌吸水纸吸无菌吸水纸吸干干0.1%氯化汞溶液氯化汞溶液无菌水冲洗无菌水冲洗1. 1.植物细胞表现出全能性的条件有哪些？植物细胞表现出全能性的条件有哪些？2.2.在植物组培过程中，为什么要进行一系列的

10、消毒，在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？灭菌，并且要求无菌操作？3 3、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？培养成小植株吗？细胞离体、一定的营养物质、细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素和其他外界条件避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。且有些杂菌会危害培养物的生长。 胡胡萝卜根形成层容易诱导成愈伤组萝卜根形成层容易诱导成愈伤组织，其他部分如叶、花也能培养成小织，其他部分如叶、花也能培养成小植株，只是稍微困难些。植株，只是稍微困难些

11、。5、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养？、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养？在有光时，往往容易形成维管在有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。组织，而不易形成愈伤组织。植物组织培养的培养基植物组织培养的培养基 定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质质 无机营养成分：无机营养成分：C C，H H，O O大量元素及部分微量元素大量元素及部分微量元素 有机营养成分有机营养成分 含含N N物质：包括维生素和氨基酸物质：包括维生素和氨基酸 碳源：碳源：2%2%5%5%的蔗糖的蔗糖 有机添加物：如琼脂起支持作用有机添加物：如琼脂起

12、支持作用 激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 PHPH值：值：5.05.06.06.0杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化植物体细胞杂交的过程植物体细胞杂交的过程植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A A原生质体原生质体B B原生质体原生质体A A杂种杂种细胞细胞ABAB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？促进融合促进融合的方法？的方法？融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B B 1两两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇个来自不同植物

13、的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？到的第一个障碍是什么？ 2怎么样去解决这个障怎么样去解决这个障碍？碍？ 3两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？什么特性有关？基基本技术：本技术：（1）去除细胞壁：）去除细胞壁： 酶酶解法解法纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶（2）人工诱导细胞原生质体融合：）人工诱导细胞原生质体融合： 物物理法：离心、振动、电激等理法：离心、振动、电激等 化化学法：聚乙二醇（学法：聚乙二醇（PEG）（3）杂种细胞培育：）杂种细胞培育： 植植物组织培养物组织培养意意义：义： 克克服服远源杂交不亲和远源杂交不亲和的障碍、在的障

14、碍、在培育作物新品种培育作物新品种方面，可大大扩展可用于杂交的亲本组合范围。方面，可大大扩展可用于杂交的亲本组合范围。未解未解决的问题：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲决的问题：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良。代的优良。 1.微型繁殖微型繁殖 微型繁殖技术微型繁殖技术:快速繁殖优良品种的植物组快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。织培养技术。 二植物细胞工程的实际应用二植物细胞工程的实际应用特点特点:保持优良品种的遗传特性；保持优良品种的遗传特性； 高效快速地实现种苗的大量繁殖。高效快速地实现种苗的大量繁殖。 (1)材料材料:无病毒的茎尖。无病毒的茎尖。 (2)脱毒苗脱毒苗:切

15、取茎尖进行组织培养获得。切取茎尖进行组织培养获得。2.作物脱毒3.神奇的人工种子神奇的人工种子 (1)技术技术:植物组织培植物组织培养。养。(2)结构结构:人工薄膜胚人工薄膜胚状体或不定芽或顶芽状体或不定芽或顶芽或腋芽。或腋芽。(3)特点特点:保持亲本优良性状；保持亲本优良性状；不受气候不受气候,季节和地季节和地域限制。域限制。 人人工种子的概念中包含的工种子的概念中包含的“具有正常发育具有正常发育能力的材料能力的材料”通常是指胚状体（目前国外有使通常是指胚状体（目前国外有使用不定芽、顶芽和腋芽的），它可以由三种途用不定芽、顶芽和腋芽的），它可以由三种途径产生：径产生：A A、由已脱分化的外植

16、体直接产生；、由已脱分化的外植体直接产生；B B、由愈伤组织产生；、由愈伤组织产生；C C、由悬浮细胞培养产生。、由悬浮细胞培养产生。对对胚状体的基本要求：胚状体的基本要求： 播种后能快速出苗播种后能快速出苗； 根和芽几乎同时生长，不产生愈伤组织根和芽几乎同时生长，不产生愈伤组织； 同步化程度高同步化程度高； 活力强活力强； 形成的幼苗的形态与生长要正常。形成的幼苗的形态与生长要正常。“外面包被着特定的物质外面包被着特定的物质”是指人工种皮，是指人工种皮，对人工种皮的要求是：能保持胚状体的活力，对人工种皮的要求是：能保持胚状体的活力，有利于贮藏运输和萌发。选取的材料要有韧有利于贮藏运输和萌发。

17、选取的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害，含有胚状体发性，耐压，对胚状体无毒害，含有胚状体发芽所需要的营养成分或植物激素，还应含有芽所需要的营养成分或植物激素，还应含有杀菌剂，以防播种后微生物的侵害。杀菌剂，以防播种后微生物的侵害。植植物人工种子制备技术的主要流程物人工种子制备技术的主要流程图图： 外植体外植体 诱诱导植物愈伤组织导植物愈伤组织 体体细胞胚的诱导细胞胚的诱导 体体细胞胚细胞胚的成熟的成熟 体体细胞胚的机械化包细胞胚的机械化包裹裹 贮贮藏或种植藏或种植 1.单倍体育种单倍体育种 (1)方法方法:花药离体培养。花药离体培养。 (2)优点优点: 后代稳定遗传后代稳定遗传,都是纯合体都

18、是纯合体; 明显缩短育种年限。明显缩短育种年限。2.突变体的利用突变体的利用 (1)产生产生:植物组织培养；植物组织培养； (2)利用利用:筛选对人们有利突变体筛选对人们有利突变体,进而培育新品种。进而培育新品种。单单倍体育种的实验流程。倍体育种的实验流程。花花药药花粉细花粉细胞培养胞培养愈伤愈伤组织组织分化出分化出小植物小植物单倍体单倍体植株植株正常正常植株植株接种接种脱分化脱分化再分化再分化移栽移栽染色体加倍染色体加倍1.种类种类:蛋白质蛋白质,脂肪脂肪,糖糖类类,药物药物,香料香料,生物碱等。生物碱等。2.技术技术:植物的组织培养植物的组织培养。第一步，选择人参根作为外植体进行培养，产第

19、一步，选择人参根作为外植体进行培养，产生愈伤组织，经过培养选择找到增殖速度快而生愈伤组织，经过培养选择找到增殖速度快而且细胞内人参皂甙含量高的细胞株作为种质，且细胞内人参皂甙含量高的细胞株作为种质，其中一部分作为保存用，以备下一次生产用，其中一部分作为保存用，以备下一次生产用，一部分进行发酵生产。一部分进行发酵生产。第二步，将第一步选择到的细胞株在发酵罐中第二步，将第一步选择到的细胞株在发酵罐中的适合培养液中进行液体培养，增加细胞数量。的适合培养液中进行液体培养，增加细胞数量。第三步，将发酵罐中培养的细胞进行破碎，从第三步，将发酵罐中培养的细胞进行破碎，从中提取人参皂甙。中提取人参皂甙。植物组

20、织培养技术在我们生活中的另外植物组织培养技术在我们生活中的另外一些应用一些应用 ： a a. . 拯救濒危植物；拯救濒危植物； b b. . 提供食品制作的原料；提供食品制作的原料； c c. . 利用愈伤组织进行转基因操作利用愈伤组织进行转基因操作( (基基因工程），培育作物新类型。（参阅必因工程），培育作物新类型。（参阅必修修IP119IP119） 课堂小结植物细胞工程植物细胞工程细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产植物组织培养植物组织培养植物繁殖的新途径植物繁殖的新途径实际应用实际应用基本技术基本技术作物新品种的培育作物新品种的培育1植物细胞表现出全能性的必要条件是植物细胞表现出全能

21、性的必要条件是 （ ）A.给予适宜的营养和外界条件给予适宜的营养和外界条件B.导入其他植物细胞的基因导入其他植物细胞的基因C.脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件D.将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞内将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞内2细胞具有全能性的原因是细胞具有全能性的原因是 （ ）A.生物体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜生物体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能能B.生物体的每一个细胞都具有全能性生物体的每一个细胞都具有全能性C.生物体的每一个细胞都含有个体发育的全部基生物体的每一个细胞都含有个体发育的全部基因因D.生物体的每一个细胞都是由

22、受精卵发育来的生物体的每一个细胞都是由受精卵发育来的3.下列植物细胞全能性最高的是下列植物细胞全能性最高的是 （ ）A.形成层细胞形成层细胞 B.韧皮部细胞韧皮部细胞 C.木质部细胞木质部细胞 D.叶肉细胞叶肉细胞CCA4.生物体内细胞没有表现出全能性，原因是生物体内细胞没有表现出全能性，原因是 （ ）A.细胞丧失了全能性细胞丧失了全能性B.基因的表达有选择性基因的表达有选择性C.基因发生了变化基因发生了变化D.不同细胞基因不同不同细胞基因不同5植物组织培养过程中的脱分化是指植物组织培养过程中的脱分化是指 （ ）A.植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B

23、.未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程 C.植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程组织的过程D.取植物的枝芽培育成一株新植物的过程取植物的枝芽培育成一株新植物的过程6植物组织培养是指植物组织培养是指 （ ）A离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织B愈伤组织培育成植株愈伤组织培育成植株C离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体D愈伤组织形成高度液泡化组织愈伤组织形成高度液泡化组织BCC7不能人工诱导原生质体融合的方法是不能人工诱

24、导原生质体融合的方法是 （ ）A.振动振动 B.电刺激电刺激 C.PEG试剂试剂 D重压重压8植物体细胞杂交要先去除细胞壁的原因是植物体细胞杂交要先去除细胞壁的原因是 （ ）A.植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁B.细胞壁使原生质体失去活力细胞壁使原生质体失去活力C.细胞壁阻碍了原生质体的融合细胞壁阻碍了原生质体的融合 D.细胞壁不是原生质的组成部分细胞壁不是原生质的组成部分9植物体细胞杂交的结果是植物体细胞杂交的结果是 （ ）A. 产生杂种植株产生杂种植株 B产生杂种细胞产生杂种细胞C原生质体融合原生质体融合 D形成愈伤组织形成愈伤组织10植物体细胞杂交的目

25、的中错误的是植物体细胞杂交的目的中错误的是 （ ）A.把两个植物体的优良性状集中在杂种植株上把两个植物体的优良性状集中在杂种植株上B.获得杂种植株获得杂种植株C.克服远源杂交不亲和的障碍克服远源杂交不亲和的障碍D.实现原生质体的融合实现原生质体的融合D DC CA AD D11植物组织培养的用途中不正确的是植物组织培养的用途中不正确的是 （ ）A.快速繁殖快速繁殖 B.生产新品种生产新品种 C生产杀虫剂生产杀虫剂 D生产白细胞介素生产白细胞介素212.能刺激愈伤组织形成的激素是能刺激愈伤组织形成的激素是 （ ） A细胞分裂素细胞分裂素 B. 赤霉素与乙烯赤霉素与乙烯 C. 细胞分裂素与生长素细

26、胞分裂素与生长素 D. 赤霉素赤霉素DC动动物细胞培养物细胞培养 动动物细胞培养就是从动物机体内取出相物细胞培养就是从动物机体内取出相关关的组的组织，将它分散成单个细胞，然后，织，将它分散成单个细胞，然后，放在放在适宜适宜的培养基中，让这些细胞生长和的培养基中，让这些细胞生长和增殖。增殖。阅读思考：阅读思考：1 为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？ 怎样分散？怎样分散？2 用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要 成分是什么？用胃蛋白酶行吗？成分是什么？用胃蛋白酶行吗？3 什么是细胞贴壁和细胞接触抑制？什么是细胞贴壁和

27、细胞接触抑制？4 什么是原代培养和传代培养？传代培养的细胞什么是原代培养和传代培养？传代培养的细胞 具有具有 什么特点？什么特点？为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？怎样分散？为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？怎样分散？1.成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生成块的组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增值。长和增值。2.从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋从健康动物体内取出组织块，剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理白酶处理用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？是什么？用胃蛋白酶行吗

28、？1.在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。间的物质主要是蛋白质。2.动物细胞培养适宜的动物细胞培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下胃蛋白酶，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。动物细胞生长特性：动物细胞生长特性：细胞贴壁：细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞贴壁。要求：要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。

29、细胞的接触抑制细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。制。 什么是原代培养和传代培养？什么是原代培养和传代培养？原代培养：将动物组织用胰蛋白酶处理成单个细胞，配原代培养：将动物组织用胰蛋白酶处理成单个细胞，配制成一定浓度的悬浮液，放入培养瓶中在培养箱中培养制成一定浓度的悬浮液，放入培养瓶中在培养箱中培养的过程的过程传代培养：培养瓶中的细胞越来越多，用胰蛋白酶处理传代培养：培养瓶中的细胞越来越多，用胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成悬浮液，分瓶

30、培养的使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成悬浮液，分瓶培养的过程过程回顾：动物细胞培回顾：动物细胞培养过程养过程动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物的组织、器官的组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变，保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变

31、化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。细胞株：细胞株：一般说一般说遗传物质未改变遗传物质未改变细胞系：细胞系：遗传物遗传物质已改质已改变变原原代代培培养养动物细胞培养条件：动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营

32、养、营养（葡萄糖葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清动物血清等。等。）3、温度和、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.44、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5% CO2 ）保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖动物细胞培养液的主要成分动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。与植物培养基相比其特点是：与植物培养基相比其特点是：（1 1）液体培养基液体培养基（2 2）含有动物血清含有动物血清动物体细胞大都生活动物体细胞大都生活在在液体液体的环境的环境

33、动物细胞培养应用动物细胞培养应用 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）单克隆抗体） 获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据一、动物细胞融合一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动物动物细胞细胞融合融合诱导方式诱导方式物理法物理法化学法化学法生物法：

34、生物法： 灭活的病毒灭活的病毒仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性 （诱导细胞融合）（诱导细胞融合）诱导方法诱导方法细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒细胞融合与诱导细胞融合物质：细胞融合与诱导细胞融合物质： 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染

35、细胞，而不能诱导细胞融合。 细胞融合技术应用于哪些方面？细胞融合技术应用于哪些方面？ 细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙

36、二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体二、单克隆抗体二、单克隆抗体 抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。疫功能的球蛋白。浆细胞产生抗体。浆细胞产生抗体。想一想想一想:什么是抗体？什么是抗体？B B淋巴细胞与抗体的关系：淋巴细胞与抗体的关系：B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。抗体。动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种淋巴细胞可以产生百

37、万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。 所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？怎样解决这个问题？ 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B 抗体抗体抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯筛选单一效应筛选单一效应B细胞细胞不能增殖产生大量抗体不能增殖产生大量抗体特异性差、纯度低；特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏产量低、反应不够灵敏读下面一段文字资料，思考以下问题：读下面一段文字资料，思考以下问题： 长期以

38、来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以产生多达百万种以细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个上的特异性抗体，但是每个B B细胞只分泌一种化学性质单细胞只分泌一种化学性质单一、特异性

39、强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个单个B B细胞进行无性繁殖，即克隆。细胞进行无性繁殖，即克隆。 1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念。、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念。2、如何大量生产单克隆抗体？、如何大量生产单克隆抗体？提示提示1 1：仅用细胞培养技术可行吗？：仅用细胞培养技术可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示提示3 3：有什么方法能使：有什么方法能使B B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无 限增殖能力同时具备呢？限增殖能力

40、同时具备呢？用单个用单个B B细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B B淋巴细胞经过无性繁殖（克淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度特异性强、灵敏度高高、产产量量高高、纯度高纯度高如何大量生产单克隆抗体？如何大量

41、生产单克隆抗体？ 利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将利用细胞融合的技术将两种细胞融两种细胞融合合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞如何筛选？如何筛选？融融合合方方式？式？ 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够

42、数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1 1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有的遗传物质，不仅具有B B细胞分泌抗体的能细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体得大量单克

43、隆抗体3 3、整个制备过程为何要经过两次筛选、整个制备过程为何要经过两次筛选? ?（第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二次需先（第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞能产生特异性抗体的细胞群。群。 由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的克隆抗体。这里的单克隆单克隆确有确有单个

44、细胞单个细胞克隆的含义，克隆的含义，只不过克隆的不是只不过克隆的不是B B淋巴细胞，而是淋巴细胞，而是杂交瘤细胞杂交瘤细胞。）。） 单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1 1、临床诊断、临床诊断2 2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹” 治疗肿瘤治疗肿瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血

45、液病、体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。踪及心肌梗塞的诊断。小结小结两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法灭活一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒病毒一个新细胞杂交瘤细胞

46、一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_ 5、C过程指细胞培养，该过

47、程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC1 1、在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（、在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（ ）A A细胞一直在细胞悬液中分裂生长细胞一直在细胞悬液中分裂生长B B有少部分细胞可能在培

48、养条件下无限地传代下去有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去C C有部分细胞核型会发生变化有部分细胞核型会发生变化 D. D. 个别细胞会发生基因突变个别细胞会发生基因突变2 2、下列过程与细胞培养无关的是、下列过程与细胞培养无关的是-（ ） A.A.检测有毒物质检测有毒物质 B.B.生产单克隆抗体生产单克隆抗体 C.C.筛选抗癌药物筛选抗癌药物 D.D.杂交育种杂交育种AD三、动三、动物体细胞核移植技术物体细胞核移植技术: 将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉 细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一

49、个新 的胚胎，的胚胎， 这个新的胚胎最终发育成动物个体。这个新的胚胎最终发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动物称为用核移植的方法得到的动物称为克隆动物克隆动物核移植核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植（难度高难度高）胚胎移植技术胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程试管动物（婴儿）培养过程卵细胞卵细胞精子精子体外受精体外受精受精卵受精卵胚胎胚胎新个体新个体母体子宫内母体子宫内孕育、产出孕育、产出绵羊绵羊“多莉多莉” 整个克隆过程如下：整个克隆过程如下：母绵羊母绵羊A 乳腺细胞乳腺细胞（体细胞）（体细胞） 母绵羊母绵羊B未受精的未受精的卵细胞卵细胞 母绵羊母绵羊C“多莉多莉” 新的卵细胞新的卵细胞 发育成胚胎发育成胚胎去核卵细胞去核卵细胞提取细胞核提取细胞核细胞融合细胞融合胚胎移植胚胎移植黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利细细胞工程名称：胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 实实施细胞工程时，所需受体施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原细胞大多采用卵母细胞的原因：因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全