RNA的提取方法

1、RNA的提取（TRIzol法）TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氧酸肌/酚法、酚/SDS法、盐酸服法、硫氧酸肌法等相比，最大特点就是可同时分离一个样品的RNA/DNA/蛋日质。TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醴沉淀可回收RNA，用乙醴沉淀中间层可回收DNA,用异丙醴沉淀有机相可回收蛋日质。TRIzol试齐I可用于小量样品（50-100mg组织）也适用于大量样品（A1g组织）。可同时处理大量不同

2、样品，整个提取过程在一个小时内即可完成。分离的总RNA无蛋日质和DNA污染，可用于NorthernBlot,dotblot,ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseI处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋日质可用于WesternBlotting。规格：100mL黄色透明液体，储存条件：2-8C避光保存12个月，注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗，乙醇会加重灼伤程度。1、预防RNase

3、污染注意事项（1）经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源。（2）使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。（3）RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗，高温灭菌。即可去除RNase。（4）配置溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v，放置过夜，高压灭菌。注意DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）试剂准备：氯仿、异丙醴、75%乙醴、无RNase的水

4、或0.5%SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制2、注意事项从少量样品（1-10mg组织）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mLTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10gRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/mL是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。3、常见问题分析 得率低样品裂解或匀浆处理不彻底；RNA沉淀未完全溶解。 A260/A280<1.65检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低PH值条件下A280值偏高；样品匀浆时加的试剂量太少；匀浆样品时未在室温放置5min;吸取水相时混入了有机相；RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解组织取出后没有马上处理或冷冻；待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C;溶液或离心管未经RNase去除处理。 DNA污染样品匀浆时加的试剂量太少；样品中含有有机溶剂(如乙醴、DMS。等),强缓冲液或碱性溶液。蛋日聚糖和多糖污染沉淀RNA(加100%异丙醴)的过程中作以下改进可去除这些污染，即每使用1mLTRIzol在水相中加0.25mL异丙醴和0.25mL高盐酸溶液(0.8M柠檬酸和1.2MNaCl)混合