实验七 重组DNA的转化

1、实验六、重组实验六、重组DNA的转化的转化 学习将体外重组DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出重组子的常用方法。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻（0）的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在丰富培养基（SOC）上生长数小时后，球状细胞复原并分裂

2、增殖，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 本实验所用重组DNA的载体带有E. coli中的-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成蓝色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。四、仪器设备四、仪器设备五、实验用具五、实验用具恒温金属浴恒温金属浴 冰箱冰箱 高压灭菌锅高压灭菌锅 超净工作台超净工作台 冷冻高速离心机冷冻高速离心机 恒温摇床恒温摇床 恒温培养箱恒温培养箱冰冰盒盒 移移液液器器

3、培养皿培养皿 锥形瓶（锥形瓶（250 ml）微量离心管微量离心管（ 2 ml、1.5 ml、0.5 ml） 吸管头若干吸管头若干三、实验三、实验材料材料上次实验课的连接产物、上次实验课的连接产物、MP3MP3质粒、质粒、pSKpSK质粒、质粒、受体菌受体菌（E. coli菌株菌株DH5 ）六、试剂六、试剂l LB培养基（液体和固体，固体添加Amp）l SOB培养基（固体和液体，不添加抗生素）l 无菌双蒸水l 氨苄青霉素（Amp）l 0.1 mol/L CaCl2l X-gall IPTG七、实验步骤七、实验步骤1、感受态细胞的制备、感受态细胞的制备2、 感受态细胞的转化感受态细胞的转化（1）菌

4、种的活化：将保存于）菌种的活化：将保存于-70冰箱的冰箱的DH5 菌种在不含抗生素的菌种在不含抗生素的SOB平平板上划线培养出单菌落（板上划线培养出单菌落（37，18-2818-28小时）小时）。（2）种子液培养：挑取单菌落接种于）种子液培养：挑取单菌落接种于15ml液体液体SOB培养基中，低温（培养基中，低温（20）震荡（震荡（200 rpm200 rpm）培养）培养6-8h6-8h（ODOD6006000.60.6）。）。（3 3）细菌的扩大培养：按照）细菌的扩大培养：按照1/1001/100的体积比将种子液接种到装有的体积比将种子液接种到装有50ml50ml液体液体SOBSOB的的250

5、 ml250 ml的三角锥瓶中，于的三角锥瓶中，于37振荡振荡（250 rpm）培养约培养约2.5小时小时至至ODOD600600=0.3=0.3，然后于冰水混合物中迅速摇动冷却后放冰上备用。，然后于冰水混合物中迅速摇动冷却后放冰上备用。（4 4）在超净工作台上，将菌液分装入）在超净工作台上，将菌液分装入2ml2ml的离心管中，每管的离心管中，每管1.5 ml1.5 ml菌液。菌液。（5 5）4，5000 rpm离心离心2分钟收集菌体分钟收集菌体；弃上清液，倒置在纸巾上弃上清液，倒置在纸巾上1分钟。分钟。（6 6）加加300 ul（菌液体积的（菌液体积的1/5-4/5）预冷的预冷的0.1 mo

6、l/L CaCl2 ，手指轻弹管壁手指轻弹管壁悬浮菌体悬浮菌体，之后冰浴，之后冰浴25 min。（7 7） 4，5000 rpm离心离心2分钟收集菌体分钟收集菌体；用移液器吸取；用移液器吸取上清上清弃去弃去，保留菌保留菌体体。（8 8）加入加入50 ul预冷的预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮，小心悬浮即为感受态细胞，即为感受态细胞，4冰箱冰箱短暂短暂保存保存 。1、感受态细胞的制备（均需无菌操作）、感受态细胞的制备（均需无菌操作）在上述制备好的感受态细胞中按下表加入各成分后用吸管头温和混匀；然后冰浴30min；于42恒温金属浴上温育90s；冰浴2-3min；加入100ul预热的L

7、B培养基于37摇动（200rpm）45分钟；期间按照每块Amp平板加入50ul液体LB、40ul X-gal和7ul IPTG涂板，并于37温育至表面液体完全吸收；取150ul培养物涂板，然后将培养皿置于室温至液体被吸收；倒置培养皿，37培养过夜；观察转化结果。2、感受态细胞的转化（超净工作台进行）、感受态细胞的转化（超净工作台进行）感受态细胞 无菌水连接物载体质粒重组质粒空白对照50 l2 l000CK(阴性对照)50 l001l (10 ng)0CK(阳性对照)50 l001 l (10 ng)自我环化对照50 l02 l00处 理50 l02 l00注意事项注意事项1、为了达到较高的转化

8、效率，LB和SOC液体培养基需用进口的胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出粉（Yeast extract）。2、转化实验使用的玻璃器皿、微量吸管、离心管管，应彻底洗净并进行高压消毒，表面去污剂、化学试剂的污染将大大降低转化率。微量吸管应剪去尖端扩大口径。3、制备感受态细胞的培养时间最好以OD值来决定。对某种菌株在培养后不同时间取样测定OD600值，比较不同OD值时细胞的转化效率，以确定对该种菌株的最佳OD值，以后每次实验就以确定的OD值为指标选用细胞培养时间。4、转化态细胞应尽量保持低温，离心管应提前预冷；受体菌细胞经CaCl2处理后，细胞壁较脆，悬浮时小心操作。5、一般菌种活化中午进行，培

9、养至次日早上菌落较大，然后按每个一般菌种活化中午进行，培养至次日早上菌落较大，然后按每个12ml培养管培养管0.8-1ml摇种子液（最好吸取液体培养基将整个大菌落全部吸至培养基中），大约摇种子液（最好吸取液体培养基将整个大菌落全部吸至培养基中），大约3-4个小时菌液稍浑浊时按照个小时菌液稍浑浊时按照1/100比例接入大瓶培养，约比例接入大瓶培养，约2.5-3h可摇至可摇至OD600=0.3。（以上为一般的制备培养程序，本实验根据上课时间对培养程序进行了调整。）（以上为一般的制备培养程序，本实验根据上课时间对培养程序进行了调整。）1、细菌液体培养一般经历四个时期，即延缓期（又称调整期）、对数期、

10、稳定期和衰亡期。制备感受态细胞应使用处于对数生长期或者对数生长前期的细菌。通常细菌在接种3-8小时内，菌体的活性、形态和代谢等各项生理指标均处于最好的时期，此时细菌培养物的OD6000.2-0.4。2、为达到高效转化，活细胞数目应该少于108细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20分钟测定OD600值，当OD600达到0.35时，收获细菌培养物。用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞注意事项用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞注意事项细菌生长曲线细菌生长曲线3、微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度降低细胞转化效率，因此最好建

11、立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水充满，再经高温高压消毒。4、制备感受态细胞的菌种不应该使用在实验室中连续传代或存放于4或室温的培养物，而应该使用冻存于-70的储备菌直接培养。5、制备感受态细胞过程中，不应该用枪头吸打的方式悬浮细胞。6、实验表明，细胞于4在CaCl2溶液中保存24-48h，在贮存的12-24h内，转化效率增加4-6倍，然后降低到初始水平。7、若长期保存，则加入等体积30%甘油于-70保存备用。8、对大多数克隆方面的用途来说，50ul感受态细胞悬液已足够了。一般25ng DNA/50ul感受态细胞，其中DNA体积不应超过感

12、受态的5%。9、当用连接产物做转化时，它比超螺旋质粒DNA的转化效率至少低2个数量级，因此质粒转化时，用于涂板的培养物要少，或者进行梯度涂板。10、用CaCl2制备和转化感受态大肠杆菌转化效率一般为5106-2107个转化克隆/ug超螺旋质粒。感受态细胞制备注意事项感受态细胞制备注意事项X-gal溶液（2%，m/V）（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，20 mg/mL）配制方法：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20 mg/mL的储存液。使用玻璃管或者聚丙烯管保存储存液。装有X-gal溶液的试管需用铝箔包裹以防因光照而破坏，并应贮存于-20。 X-gal溶液无需过滤除菌。IPTG（20%

13、， m/V，0.8mol/L） （异丙基-D-1-硫代半乳糖苷，200 mg/mL）用8ml ddH2O溶解2g IPTG配制成20%的溶液，用蒸馏水定容至10ml.yong 0.22um的过滤器过滤除菌。分装成1ml小份，贮存于-20。直径为直径为9mm9mm的培养皿：的培养皿：40ul 40ul X-gal溶液溶液+ 7ul IPTG用用X-gal和和IPTG筛选细菌菌落：筛选细菌菌落：-互补互补X-gal和IPTG直接用于琼脂平板：高浓度的X-gal溶液直接铺于预支的琼脂平板表面，在含有适当抗菌素的预支90mm琼脂平板中央滴加40ul 2% X-gal和7ul 20% IPTG。用一个无

14、菌的涂布器拨散X-gal溶液，使之分散于培养板整个表面，于37温育至全部液体消失。 -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）和）和-互补互补1、由四个相同的亚基组成，每个亚基包含和片段。2、lacZ M15编码片段，当M15缺失（M15）时lacZ基因只能表达片段，-半乳糖苷酶则没有活性。3、当带有lacZ M15（片段）基因的lac操纵子通过载体DNA转入到lacZM15基因型的细菌细胞中，在诱导物存在的情况下，-半乳糖苷酶表现出活性，它能分解X-gal，使菌落呈现蓝色。AmproripSKII(3 kb)MCS(多克隆位点)Lac promoterlacZ (lacZ M15)-半乳糖苷酶基因

15、No IPTG, little expression of -galactosidase geneWith IPTG, efficient expression of -galactosidase gene.lacZM15E. coli cell（乳糖）（乳糖）（别乳糖）（别乳糖）（葡萄糖）（葡萄糖）（半乳糖）（半乳糖） IPTG与别乳糖结构相似，但不能被降解。也能与阻遏蛋白结合起去阻遏作用，常作为lac操纵子的诱导剂而使用。卫星菌落卫星菌落转带有Amp+质粒的转化菌铺平板时，密度应较低（每个90mm平板不超过104菌），于37 培养的时间不超过20h。 Amp+抗性的转化体可将-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对Amp敏