实验四 感受态细胞的制备

1、分子生物学实验分子生物学实验实验四大肠杆菌感受态细胞的制备分子生物学实验分子生物学实验v1 1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理。掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理。v2 2、学习学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞法制备大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。的方法和技术。分子生物学实验分子生物学实验实验原理实验原理1、感受态细胞制备原理：、感受态细胞制备原理：受体细胞经过一些特受体细胞经过一些特殊方法殊方法(如电击法、如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法等化学试剂法)处处理后，理后，细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变了暂时性的改变，成为允许

2、外源成为允许外源DNA分子进入的分子进入的感受态细胞感受态细胞(Compenent cells)。u（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域）分子生物学实验分子生物学实验2、感受态转化原理：、感受态转化原理：细菌处于细菌处于0的的CaCl2低渗溶低渗溶液中，细胞膜的通透性发生变化，同时转化混合液中，细胞膜的通透性发生变化，同时转化混合物中的质粒物中的质粒DNA会形成抗会形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过

3、合物黏附于细胞表面，经过42短时间的热激处短时间的热激处理，促进感受态细胞吸收理，促进感受态细胞吸收DNA复合物，在培养液复合物，在培养液中生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在中生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。选择培养基上可获得所需的转化子。实验仪器实验仪器超净工作台超净工作台离心设备离心设备台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机制冰机制冰机分子生物学实验分子生物学实验1、实验材料：、实验材料：E. coli JM109。2、实验试剂：、实验试剂：(1)LB液体培养基：称取胰蛋白胨液体培养基：称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物，酵母提取物 5 g，NaC

4、l 10 g，加双蒸水至总体积，加双蒸水至总体积1L，高压下蒸气灭菌。，高压下蒸气灭菌。(2) 0.1mol/L CaCl2溶液：称取溶液：称取1.1098g CaCl2(无水无水,分析纯分析纯)，溶于溶于90mL重蒸水中，定容至重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。，高压灭菌。(3) 30%甘油：量取甘油：量取30mL甘油，加入甘油，加入70 mL双蒸水，双蒸水， 混匀，混匀，定容至定容至100mL ，高压灭菌。，高压灭菌。分子生物学实验分子生物学实验1. 菌体的培养菌体的培养(事先已做事先已做) 受体菌的培养受体菌的培养从从 LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli JM10

5、9单菌落单菌落，接种于接种于35 mL LB液体培养基中液体培养基中，37下振荡培养下振荡培养 12 hr 左右左右，直至对数生长直至对数生长后后期。期。 将该菌悬液以将该菌悬液以 1: 1001: 50 的比例接种于的比例接种于50mL LB液体培养基中液体培养基中，37振荡培养振荡培养23 hr，至至OD600为为0.30.4。分子生物学实验分子生物学实验 取取2个个1.5mL离心管离心管，分别，分别转入转入1mL菌菌液液，4 12000 rpm，离心离心2 min。 弃去上清弃去上清，每管加入，每管加入1mL预冷的预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶溶液液，悬浮细胞悬浮细胞，冰上放

6、置冰上放置 30 min。 4 ，12000 rpm，离心离心2 min。 弃去上清弃去上清，每管，每管加入加入50L预冷预冷的的0.1 mol/LCaCl2 溶溶液液，轻轻缓缓悬浮细胞悬浮细胞,50L预冷的预冷的30%甘油甘油，冰上放置冰上放置5 min，即即为为感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。 将将感受态细胞悬液感受态细胞悬液，放置于，放置于-80，可保存半年。可保存半年。2. 感受态细胞的制备感受态细胞的制备 (CaCl2 法，超净台内法，超净台内)分子生物学实验分子生物学实验第二天，第二天， CaCl2 法法前一天晚上，前一天晚上，第二天早上第二天早上分子生物学实验分子生物学实验结果分

7、子生物学实验分子生物学实验注意事项1.1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从-80-80甘油保存的菌种中直接转接甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。用于制备感受态细胞的菌液。2.2.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的测培养液的ODOD600600来控制。来控制。JM109JM109菌株的菌株的ODOD600600为为0.30.30.40.4密度比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。密度比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。3.3.实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。成菌体破裂，影响转化。4.4.实验过程中要注意无菌操作，