基础化学理论-第13章 可见分光光度法与紫外分光光度法ppt课件

1、第十三章第十三章 可见和紫外分光光度法可见和紫外分光光度法Visible and Ultraviolet SpectrophotometryVisible and Ultraviolet Spectrophotometry Light spectrum350nm800 nm500 mm1 cm1000.1X-rayg-rayUV &Vis IRMWRadio分光光度法：根据物质的吸收光谱及光的吸收定分光光度法：根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定量定性分析的一种分析方法律，对物质进行定量定性分析的一种分析方法灵敏度高，检出限灵敏度高，检出限 10-510-6 mol L-1(

2、 微量及痕微量及痕量组分量组分)准确度较高准确度较高:相对误差：相对误差：2% 5% ， 若使用精密仪器相对误差可降至若使用精密仪器相对误差可降至1-2。波谱名称波谱名称 波长范围波长范围 分分 析析 方方 法法 射线射线 0.005 0.17nm 中子活化分析，穆斯堡尔谱法中子活化分析，穆斯堡尔谱法 X射线射线 0.1 10nm X射线光谱法射线光谱法 远紫外远紫外 10 200nm 真空紫外光谱法真空紫外光谱法 近紫外近紫外 200 400nm 紫外光谱法紫外光谱法 可见光可见光 400 760nm 比色法比色法，可见吸光光度法可见吸光光度法 近红外近红外 0.76 2.5 m红外光谱法红

3、外光谱法 中红外中红外 2.5 50 m红外光谱法红外光谱法远红外远红外 50 1000 m红外光谱法红外光谱法 微微 波波 1 1000 mm 微波光谱法微波光谱法 射射 频频 1 1000 m 核磁共振光谱法核磁共振光谱法 13.1物质的吸收光谱物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 M(基态基态) + h M*(激发态激发态) M(基态基态) + h M*(激发态激发态)互补色光示意图互补色光示意图光的互补：黄光的互补：黄篮篮物质的物质的颜色颜色 吸吸 收收 光光 物质的物质的颜色颜色 吸吸 收收 光光 颜色颜色 /nm颜色颜色 /nm黄绿黄绿 紫紫 400 450紫紫 黄绿黄绿 56

4、0 580 黄黄 蓝蓝 450 480 蓝蓝 黄黄 580 600 橙橙 绿蓝绿蓝 480 490 绿蓝绿蓝 橙橙 600 650 红红 蓝绿蓝绿 490 500 蓝绿蓝绿 红红 650 760 紫红紫红 绿绿 500 560 物质的颜色与吸收光颜色的互补的关系物质的颜色与吸收光颜色的互补的关系三邻二氮菲合铁（三邻二氮菲合铁（）离子）离子的吸收光谱的吸收光谱 将不同波长的光通过一定浓度的溶液，分别测定将不同波长的光通过一定浓度的溶液，分别测定溶液对各种波长的光的吸光度。以入射光的波长溶液对各种波长的光的吸光度。以入射光的波长 为横坐标，相应的吸光度为横坐标，相应的吸光度 A A 为纵坐标作图，

5、可得到为纵坐标作图，可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称为吸收曲线或吸收一条吸光度随波长变化的曲线，称为吸收曲线或吸收光谱。光谱。吸收篮绿色的光，显示橙红色吸收篮绿色的光，显示橙红色最大吸收波长最大吸收波长max吸收曲线吸收曲线吸收曲线讨论吸收曲线讨论同一物质对不同波长光的吸光度不同，吸光度同一物质对不同波长光的吸光度不同，吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大处对应的波长称为最大吸收波长max；不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似似,max不变；而对于不同的物质，它们的吸不变；而对于不同的物质，它们的吸收曲线形状和收曲线形状和max不相同；不相同

6、；从吸收曲线形状可以解释物质的颜色，物质的从吸收曲线形状可以解释物质的颜色，物质的颜色与吸收光颜色互为补色。颜色与吸收光颜色互为补色。13.2分光光度法基本原理分光光度法基本原理I0Itbt0lglgII=T-=A0II=Tt透光率和吸光度透光率和吸光度透光率透光率 吸光度吸光度透光率和吸光度的关系透光率和吸光度的关系t0lgII=ALambert-Beer law1760 年，年， Lambert 指出：一束平行单色光通过指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。比。 A = k1 d1982年，年，Beer 指出：一

7、束平行单色光通过有色溶指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。 A = k2 cB将将 Lambert 定律和定律和 Beer 定律合并起来，就得到定律合并起来，就得到 Lambert-Beer 定律。定律。 Lambert-Beer 定律定律A = b c b：液层厚度：液层厚度 （cm）；）；c：物质的量浓度：物质的量浓度molL-1); :摩尔吸光系数摩尔吸光系数Lmol-1cm-1）。）。LambertBeer定律是吸光光度法的理论基础和定律是吸光光度法的理论基础和定量分析的依据，广泛应用于紫外光、可见光、定量分析的依据

8、，广泛应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量，也适用于原子吸收测量。红外光区的吸收测量，也适用于原子吸收测量。 摩尔吸光系数摩尔吸光系数Lmol-1cm-1） 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，不随浓吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，不随浓度度c和光程长度和光程长度b的改变而改变，在温度和波长等条件一的改变而改变，在温度和波长等条件一定时，定时， 仅与吸收物质本身的性质有关；仅与吸收物质本身的性质有关； 同一吸收物质在不同波长下的同一吸收物质在不同波长下的max不同；不同； max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了吸光光度法

9、测定该物质可能达到的最大灵敏度，了吸光光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度，max越大，表明该物质的吸光能力越强，用光度法测越大，表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高，定该物质的灵敏度越高，1000即可进行分光光度法测即可进行分光光度法测定。定。A = b c 例例13-1 13-1 用邻菲罗啉法测定铁，知用邻菲罗啉法测定铁，知 Fe2+ Fe2+ 的质量的质量浓度为浓度为 1.0 1.010-3 gL-110-3 gL-1。用。用2cm2cm吸收池，在波长吸收池，在波长508508nm nm 处测得吸光度处测得吸光度A A 为为0.380.38，计算铁，计算铁()-()-

10、邻菲罗邻菲罗啉配离子的摩尔吸收系数。啉配离子的摩尔吸收系数。解：解：Fe2+Fe2+浓度为：浓度为：2+312+512+1(Fe )1.0 10 g L(Fe )1.8 10 mol L(Fe )55.85g molcMr-1mol Fe2+能生成1mol Fe ()- 邻菲罗啉配离子，因此配离子浓度也为 。511.8 10 mol L-52151B0.381.1 10 dmmol1.8 10 mol L0.2dmAc d-bc13.3 可见分光光度法可见分光光度法一、分光光度计一、分光光度计光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器显示器显示显示A/T窗口窗口选择波长选择波长样品室样

11、品室吸收池吸收池（比色皿）（比色皿）单一波长，没有扫描功能。单一波长，没有扫描功能。TU-1810暗室盖暗室盖TU-1810紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计样品池（一光源（一光源 对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。 分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。源两类。 热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯

12、；钨灯热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；钨灯和碘钨灯可使用的范围在和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm。 气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。它们可气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。它们可在在160 375 nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大35倍。倍。 back（二单色器（二单色器 单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色单色器是能从光

13、源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。波长且波长在紫外可见区域内任意可调。 单色器一般由入射狭缝、准光器透镜或凹单色器一般由入射狭缝、准光器透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性

14、及校准曲线的线性关系等。选择性及校准曲线的线性关系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。 棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 40

15、00nm，即可用，即可用于紫外、可见和近红外三于紫外、可见和近红外三 个光域。个光域。 光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。光谱会重叠而产生干扰。 Back（三吸收池（三吸收池 吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻吸收池

16、用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸玻璃池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中紫外区尤其重要），吸收池要度的分析测定中紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。 back（四检测器（四检测器 检测器的功能是检测信号、测量

17、单色光透过溶液后光检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。强度变化的一种装置。 常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。 硒光电池对光的敏感范围为硒光电池对光的敏感范围为300800nm，其中又以，其中又以500 600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。只能用于低档的分光光度计中。 光电管在紫外光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。可见

18、分光光度计上应用较为广泛。 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。back（五信号指示系统（五信号指示系统 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装及数字

19、显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。一方面可进行数据处理。吸光度与透光度标尺吸光度与透光度标尺back 二、测定方法及应用二、测定方法及应用 (一一) 标准曲线法标准曲线法 1、配制一系列已知浓度的标准溶液；、配制一系列已知浓度的标准溶液； 2、用同样厚度的吸收池测定其吸光、用同样厚度的吸收池测定其吸光度；度； 3、以吸光度为纵坐标，标准溶液浓、以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标度为横坐标 作图，得标准曲线作图，得标准曲线(standard curve) 或称为

20、工或称为工 作曲线作曲线(working curve) 。MMC丝裂霉素水溶液的标准曲线丝裂霉素水溶液的标准曲线051015200.00.20.40.60.81.01.2r rx UV-3150 max=364nmAbsorbanceConcertration of MMC ( g/mL ) x2503003504004500.00.20.40.60.81.01.21.4 20 10 6.68 5 4 2 0.4Concertration of MMC: g/mL Wavelength (nm)Absorbance max=364nm (二二) 标准对照法标准对照法 1、配制一个与被测溶液浓度

21、相近的标准、配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶溶 液液(其浓度用其浓度用cs表示表示)； 2、在、在max处测出标准溶液吸光度处测出标准溶液吸光度As； 3、在相同条件下测出试样溶液的吸光度、在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax； 4、试样溶液浓度、试样溶液浓度cx可按下式求得：可按下式求得： sscAxAxc (三三)比吸光系数比较法比吸光系数比较法 比吸光系数比较法是利用标准的值进比吸光系数比较法是利用标准的值进行定量测定的，即将样品的比吸光系数与行定量测定的，即将样品的比吸光系数与标准物质的比吸光系数比较，计算出样品标准物质的比吸光系数比较，计算出样品含量含量(质量分数或体积分数质量分数

22、或体积分数)。 医药学实际中有时也用比吸光系数。比吸医药学实际中有时也用比吸光系数。比吸光系数是指光系数是指100mL 溶液中含被测物质溶液中含被测物质 1g ，液，液层厚度层厚度 b 为为1cm时的吸光度值，用时的吸光度值，用 表示。表示。 1%1cmE 例如：广谱抗菌药呋喃妥因的例如：广谱抗菌药呋喃妥因的 (367nm) = 746，在相同条件下，在相同条件下，测定呋喃妥因样品的测定呋喃妥因样品的(367nm) = 738，因此，该样品中呋喃妥因的，因此，该样品中呋喃妥因的质量分数为：质量分数为： 30.9897467381%1cmE1%1cmE (四四)差示分光光度法差示分光光度法 适用

23、范围：浓度过高或过低的溶液。适用范围：浓度过高或过低的溶液。 优点：减少相对误差。优点：减少相对误差。 原理：用与待测样品浓度相近的标原理：用与待测样品浓度相近的标准溶液准溶液c1作参比溶液，测定同种未知浓作参比溶液，测定同种未知浓度度c2样品的吸光度。样品的吸光度。 如：用空白溶液做参比时如：用空白溶液做参比时T空白溶空白溶液液=100%）：）： T试样试样= I试样试样/I空白溶液空白溶液=5/100= 5%， T标准溶液标准溶液=I标准溶液标准溶液/I空白溶液空白溶液=10/100=10%；用该标准溶液做参比时（用该标准溶液做参比时（ T标准溶液标准溶液=100%）：）：T试样试样=I试

24、样试样/I标准溶液标准溶液=5/10=50%.13.4分光光度法的误差和测量条件的选择分光光度法的误差和测量条件的选择分光光度法的误差分光光度法的误差偏离偏离Beer定律的误差定律的误差仪器测量误差仪器测量误差光电管的灵敏性差、光电流测量不准、光电管的灵敏性差、光电流测量不准、光源不稳定、读数不准光源不稳定、读数不准主观误差主观误差操作不当引起，如步骤不规范，显色剂操作不当引起，如步骤不规范，显色剂用量、放置时间、反应温度等。用量、放置时间、反应温度等。 偏离偏离beer定律的原因定律的原因物理因素物理因素非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离非平行入射光引起的偏离非平行入射光引起的偏离介质不均

25、匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离化学因素化学因素溶液浓度过高引起的偏离溶液浓度过高引起的偏离化学反应引起的偏离化学反应引起的偏离 溶剂对紫外溶剂对紫外-可见光谱的影响较为复杂。改可见光谱的影响较为复杂。改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。细结构消失，吸收带变向平滑。 改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。收光谱的

26、影响。 正己烷正己烷 CHCl3 CH3OH H2O * max/nm 230 238 237 243 n *max/nm 329 315 309 305溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响 1. 波长：波长： (max) 最大最大 2. 显色剂及用量显色剂及用量 3. 溶液酸度溶液酸度 4.显色时间与稳定时间显色时间与稳定时间 5. 干扰物的掩蔽干扰物的掩蔽 6. 合适的浓度范围合适的浓度范围 线性范围及吸光度线性范围及吸光度 7.选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液 测量条件的选择测量条件的选择M + R = MR (被测物被测物) (显色剂显色剂) (有色产物有色

27、产物) ，灵敏度，灵敏度。 10000灵敏度高灵敏度高选择性好选择性好生成的有色物质应有确定的组成生成的有色物质应有确定的组成生成的有色物质应稳定生成的有色物质应稳定显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收选择适当的显色剂选择适当的显色剂控制显色反应的酸度，使显色剂仅与被测控制显色反应的酸度，使显色剂仅与被测物质起反应物质起反应加入掩蔽剂，使其与干扰离子生成更稳定加入掩蔽剂，使其与干扰离子生成更稳定的无色配合物，而与被测定物质和显色剂不的无色配合物，而与被测定物质和显色剂不发生反应发生反应在测定前预先通过离子交换、沉淀分离或在测定前预先通过离子交换、沉淀分离或溶剂萃取法等分离干扰离子溶剂萃取法等分离干扰离子共存离子的干扰及消除共存离子的干扰及消除T = 36.8% (A=0.434) 时，时， C / C最小。最小。控制范围：控制范围：T：20%65%，A：0.70.2 测量误差和透光率的关系测量