电子显微镜免疫组织化学技术

1、第七章第七章 免疫电镜免疫电镜一一 电镜免疫组织化学技术概述电镜免疫组织化学技术概述二二 几种常用的透射电镜方法要点几种常用的透射电镜方法要点一一 电镜免疫组织化学技术概述电镜免疫组织化学技术概述 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。在位置，即为抗原抗体反应的部位。 v（一）组织固定与取材（一）组织固定与取材v（二）免疫染色（二）免疫染色v（三）包埋（三）包埋 v（四）对照试验（四）对照试

2、验（一）组织固定与取材（一）组织固定与取材v原则：原则：既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。v固定：固定： 固定剂的要求：固定剂的要求： 不损害细胞内抗原的活性；不损害细胞内抗原的活性； 固定速度快、效果好；固定速度快、效果好； 分子量小，易于渗透；分子量小，易于渗透； 固定后固定后, ,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。抗原位。 影响固定的因素有：影响固定的因素有： 固定剂的种类；固定剂的种类； 固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度固定剂的浓度，浓

3、度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；过小，固定效果差； 固定剂的固定剂的pHpH； 固定剂的温度固定剂的温度, ,一般采用一般采用2244冷固定；这样能降低细冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提；胞自溶作用和水分抽提； 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；间也不一致； 与被固定的细胞类型有关。与被固定

4、的细胞类型有关。 选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛多聚甲醛戊二醛混合液戊二醛混合液 过碘酸过碘酸赖氨酸一多聚甲醛液赖氨酸一多聚甲醛液(PLP(PLP液液) )： 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。对含糖类丰富的组织固定效果特佳。（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、种类浓度、温度、pHpH及固定时间等。然后做出预处理的效价，及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。）作为失活参考以再选择最适条件。）v取材：取材：免疫电镜技术较光镜免疫

5、化学技术要求更迅速、精细。免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。灌流后需续固定：四氧化锇（二）免疫染色（二）免疫染色v包埋前染色包埋前染色 v包埋后染色包埋后染色 v超薄切片免疫染色超薄切片免疫染色 1 1 包埋前染色包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。埋。 特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋： 即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树即第一次包埋时

6、将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。需要部位作第二次包埋。 包埋前染色的组织，以中层较为理想。包埋前染色的组织，以中层较为理想。 表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。 半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAPPAP），免疫反应部位呈黑点状；），免疫反应部位呈黑点状； HEHE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。或甲苯胺蓝

7、染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。 取相连续的超薄切片取相连续的超薄切片 为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。v包埋前染色法的优点是：包埋前染色法的优点是： 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组

8、织。出率。适用含抗原量较少的组织。2 2 包埋后染色（载网染色）包埋后染色（载网染色）v组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片；组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片； 免疫组化染色（载网染色）免疫组化染色（载网染色）注意事项：注意事项： 四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。量缩短在四氧化锇中停留的时间。 在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选在载网染色过程中，铜网易与化学物

9、质产生反应，故需选用镍网或金网。用镍网或金网。 在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。面干燥会影响抗体活性。优点：优点：超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。缺点：缺点： 抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失；抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失； 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质；环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质； 包埋在环氧树脂中的

10、组织不易进行免疫反应等。包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。解决对策：解决对策：去除包埋剂：去除包埋剂：饱和苯溶液，无水酒精中饱和苯溶液，无水酒精中NaOHNaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。饱和溶液或乙氧化钠溶液等。去除四氧化锇：去除四氧化锇：免疫染色前，将载网超薄切片以免疫染色前，将载网超薄切片以H H2 20 02 2液蚀刻数分钟，以去锇和液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。增强树脂的穿透性。3 3 超薄冰冻切片超薄冰冻切片 v将组织置于蔗糖保护液中，以液氮速冻；将组织置于蔗糖保护液中，以液氮速冻；v在冰冻超薄切片机上切片；在冰冻超薄切片机上切片；v免疫染色。免疫染色。 不需经固

11、定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存 较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大件要求较高、难度较大。（三）包埋（三）包埋树脂包埋、低温包埋树脂包埋、低温包埋1 1 树脂包埋树脂包埋 环氧树脂包埋法环氧树脂包埋法 直接脱水后包埋直接脱水后包埋 原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上，原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上， 将充满环氧树脂的明胶囊倒置将充满环氧树脂的明胶囊倒置 于切片上聚合、硬化，进行包埋。于切片上聚合、硬化，进行包埋。2 2 低温包埋低温包埋 低温包埋剂：低温包

12、埋剂： （1 1）LowicrylsLowicryls： 是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括K4MK4M、HM20HM20、K1lMK1lM、KM23KM23等系列等系列产品。产品。 特点：特点： 是能在低温下保持低粘度；是能在低温下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。K4MK4M和和K11MK11M具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色；具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色；HM20HM20和和HM23HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于

13、扫描、透射电镜和暗视具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。野观察切片的制作。K4MK4M应用较多应用较多 1 1）包埋剂的配制：）包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块，其配制比例如下：中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4MK4M：单：单 体体 17.30g 17.30g 交联剂交联剂 2.70g2.70g 引发剂引发剂 0.10g0.10g 可用微量注射器加针头抽取后，注入棕

14、色玻璃容器避光，用可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用玻棒轻搅玻棒轻搅35 min35 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌，或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。以防氧的气泡进入包埋剂中。K4M K4M 的应用的应用 2) 2) 生物样品处理程序生物样品处理程序 取材，以多聚甲醛一赖氨酸取材，以多聚甲醛一赖氨酸过碘酸钠固定；过碘酸钠固定； 含含7 7蔗糖蔗糖PBSPBS，冲洗过夜；，冲洗过夜； 0.1 mol 0.1 molLPBSLPBS， pH 7.2pH 7.2冲洗；冲洗； 系列脱水；系列脱水； 包埋：包埋： 新鲜新鲜K4MK4M置于

15、胶囊内，将组织块移入，在置于胶囊内，将组织块移入，在-30-30-40-40以紫外线灯照射以紫外线灯照射24h24h使之聚合。如为使之聚合。如为100W100W灯泡，照射距离应大于灯泡，照射距离应大于85 cm85 cm。聚合后的胶囊移。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射至室温在紫外线下继续照射2 23 3天，可增加其硬度，便于切片。天，可增加其硬度，便于切片。 3) 3) 免疫染色免疫染色 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上；切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上； 正常羊血清正常羊血清30 min30 min； 稀释一抗，稀释一抗，372h372h； 可用烧杯法可用烧杯法( (或塑料壶喷洗法或塑料

16、壶喷洗法) )，以镊夹镍网在烧杯中洗荡；，以镊夹镍网在烧杯中洗荡； 正常羊血清正常羊血清30min30min。 二抗以正常羊血清稀释，以镍网置于血清滴上孵育。二抗以正常羊血清稀释，以镍网置于血清滴上孵育。 冲洗如冲洗如。 覆于覆于2 2OsO4OsO4水溶液上，水溶液上，30min30min。 冲洗如冲洗如。 干燥后在电镜下观察。干燥后在电镜下观察。 注意事项：注意事项：所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。 Lowicryls Lowicryls 应保存在暗处，一应保存在暗处，一44，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，该物

17、质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。应立即以水冲洗局部。 （2 2）LR whiteLR white和和LR goldLR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂；是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂； 具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体( (或抗原或抗原) ) 和免疫化学物质穿过和免疫化学物质穿过LRLR树脂，达到组织结合部位；树脂，达到组织结合部位； 在免疫细胞化学的光镜在免疫细胞化学的光

18、镜( (半薄切片半薄切片) )和电镜水平应用都具有良好和电镜水平应用都具有良好 效果。效果。 标本脱水至标本脱水至7070乙醇即可，能较好地保持抗原性。乙醇即可，能较好地保持抗原性。 生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。 （3 3）GMAGMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）（乙二醇甲基丙烯酸酯） 优点：优点： 电子密度大；电子密度大； 影像反差好。影像反差好。 缺点：缺点： 包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。 聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。 缺乏稳定性，不

19、能承受电子束轰击，包埋剂遇热升缺乏稳定性，不能承受电子束轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。 环氧树脂：环氧树脂：有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形；有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形；影像反差好，分辨率高；影像反差好，分辨率高；半薄切片染色不够满意，效果不如半薄切片染色不够满意，效果不如GMAGMA包埋切片的染色效果。包埋切片的染色效果。改进方法：改进方法：增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇400400改变其硬度。使之变软；改变其硬度

20、。使之变软；加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束轰击的稳定性。轰击的稳定性。选用低温型引发剂选用低温型引发剂过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构。高温，损伤组织结构。GMAGMA已广泛应用于半薄切片已广泛应用于半薄切片(1(13 um)3 um)的光镜观察，特别是的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。 1) 1) 过滤过滤: : GMA GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须单体溶液在出厂时都加有氢醌

21、类稳定剂，用前须以每以每25ml25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5 min5 min，过，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。滤以除去氢酯，以免影响聚合。 2) 2) 包埋剂的配制：包埋剂的配制： a. 100a. 100GMAGMA N- N-甲基丙烯酸丁酯甲基丙烯酸丁酯 66.5ml66.5ml 5 5乙烯二甲丙烯酸酯乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml28.5ml 1.5 1.5过氧化苯甲酰过氧化苯甲酰 1.0g1.0g 1.0 1.0PEG 400 1.0mlPEG 400 1.0ml GMAGMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免包埋剂的配制

22、、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法：疫细胞化学染色方法：b bA A液：液： GMAGMA单体液单体液 90ml90ml PFG z300 5 PFG z300 59.4 ml9.4 ml 过氧化苯甲酰过氧化苯甲酰 0.20.20.69 g0.69 g 搅拌溶解后置棕色瓶内；搅拌溶解后置棕色瓶内；44保存。保存。 B B液：液： PEG z400 20 ml PEG z400 20 ml 二甲基苯胺二甲基苯胺 1 ml1 ml 应用时应用时A A：B B按按1010：1 1比例充分混。比例充分混。3) 3) 生物样品处理：生物样品处理： 组织固定可用组织固定可用PLPPLP液或液或

23、1 1戊二醛溶液戊二醛溶液( (磷酸缓冲液配制，磷酸缓冲液配制，Ph7.4)Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的。经系列酒精脱水至新鲜的GMAGMA单体溶液中浸单体溶液中浸24h24h。 以上步骤可在室温或以上步骤可在室温或44进行。进行。 4) 4) 包埋聚合：包埋聚合： 组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在埋液中的气泡，然后在44，以紫外线灯，以紫外线灯( (波长波长360nm)360nm)在距胶在距胶囊底部囊底部101020cm20cm处进行照射处进行照射121216h16h，以手指捏胶囊试其硬，以手指捏胶囊

24、试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中以度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中以去除胶囊外壳去除胶囊外壳。 5)5) 包埋后染色包埋后染色: :切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A A技术（技术（PAgPAg法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的 包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的 多种抗原。多种抗原。（四）对照试验（四）对照试验: 略略免疫电

25、镜技术存在的问题：免疫电镜技术存在的问题： 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响；性有影响； H H2 20 02 2能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。位产生孔洞。 染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染物，影响特异性反应产物的显示和观察。物，影响特异性反应产物的显示和观察。二、几种常用的透射电镜方法要点二、几种常用的透射电镜方法要点 （一）铁蛋白标记免疫电镜技术一）铁蛋白标记免疫电镜

26、技术 （二）过氧化物酶标记免疫电镜技术（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术 （三）胶体金标记免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术 （四）凝集素标记免疫电镜技术（四）凝集素标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术 1 1 原理原理 铁蛋白：铁蛋白：是一种含铁约占是一种含铁约占2323的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核 心，含心，含2000200030003000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密 区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 抗体与铁

27、蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面抗原的定位抗原的定位 优点：优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；缺点：缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。因此，在近

28、年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。 2 2 电镜标本的制备电镜标本的制备v（1 1）固定）固定 同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定）同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定） 铁蛋白标记抗体分子量大，如用于细胞表面抗原的定位研究，铁蛋白标记抗体分子量大，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：冻融法：冻融法：固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。冰冻切片法：冰冻切片法：固定后速冻，切成固定后速冻，切成10-15um10-15um薄片，融化的切片直接薄片，融化的切片直接浸泡于铁蛋白标

29、记的抗体液中。浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中1-2min1-2min，增强细胞膜穿透性，增强细胞膜穿透性，使标记抗体进入细胞内使标记抗体进入细胞内冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图 艾滋病患者血清的免疫电镜所见。艾滋病患者血清的免疫电镜所见。在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。 在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞外所见相同的病毒颗粒。外所见相同的病毒颗粒。 培养的成纤维细胞质膜对培养的成纤维细胞质膜对LDLLDL的内吞作用的内

30、吞作用LDLLDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连，颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连， 电子显微镜下所见的黑点是小分子电子显微镜下所见的黑点是小分子的铁。（的铁。（a a）LDLLDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b b） 含有含有LDLLDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c c） 含有转铁蛋白标记的含有转铁蛋白标记的LDLLDL被膜小泡；（被膜小泡；（d d）含有转铁蛋白标记的）含有转铁蛋白标记的LDLLDL颗粒的无被小泡（初级内体）。颗粒的无被小泡（初级内体）。 （2 2） 免疫染色

31、方法免疫染色方法 常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。 （1 1）直接法：）直接法： 切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或3713712h2h以上；以上； 缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液；缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液； 再按常规电镜后固定、脱水、包埋。再按常规电镜后固定、脱水、包埋。 （2 2）间接法：）间接法： 将切片浸入一抗室温孵育将切片浸入一抗室温孵育303060min60min； 大量冷缓冲液充分洗涤大量冷缓冲液充分洗涤(3(330min)30min)； 浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育

32、浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育30min30min； 充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片；充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片； 将离心沉淀小块，用四氧化锇固定将离心沉淀小块，用四氧化锇固定3030分钟；分钟； 常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术 1 1 原理：原理：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成有较高电子密度的产物。有较高电子密度的产物。HRPHRP分子量小分子量小(40 000)(40

33、000)，穿透力强，有利于标记抗，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。2 2 方法方法（1 1）单层细胞培养物免疫酶染色法）单层细胞培养物免疫酶染色法 用用4%4%多聚甲醛原位固定多聚甲醛原位固定1h;1h; PBS PBS充分洗涤，用充分洗涤，用HRPHRP标记的抗体血清作用标记的抗体血清作用18h18h，再用，再用PBSPBS水洗；水洗； 2% 2%戊二醛固定戊二醛固定1h1h，再水洗；，再水洗； DAB DAB显色显色 锇酸固定、树脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片锇酸固定、树脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片 （2 2）组织切片酶标

34、记抗体染色法）组织切片酶标记抗体染色法 1mm 1mm厚组织块，固定后如蔗糖保护液厚组织块，固定后如蔗糖保护液; ; 做做10-40um10-40um冰冻切片，放入一抗血清作用冰冻切片，放入一抗血清作用12-18h12-18h，用含蔗糖，用含蔗糖的的PBSPBS水洗；水洗； 置于置于HRPHRP标记抗体液标记抗体液4 4 过夜，再水洗，浸漂过夜；过夜，再水洗，浸漂过夜； 戊二醛再固定戊二醛再固定1h1h，用含蔗糖的，用含蔗糖的PBSPBS水洗；水洗； DAB DAB显色；显色； 锇酸固定、脱水、树脂包埋，切片复染和观察锇酸固定、脱水、树脂包埋，切片复染和观察 vHRPHRP标记抗体，通过标记抗

35、体，通过DABDAB呈色反应，呈色反应，DABDAB分解产物为不溶性的分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过棕色吩嗪衍生物，经过Os04Os04处理后变黑，具有高电子密度，处理后变黑，具有高电子密度，适合于电镜观察；适合于电镜观察；vHRPHRP分子量比铁蛋白将近小分子量比铁蛋白将近小2020倍，酶标抗体较易透过经适当倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高物的分辨率不如颗粒性标记物高( (如铁蛋白，胶体金如铁蛋白，胶体金) )。 （3 3）包埋前）包埋前PAPPAP法：常用法

36、：常用 固定组织；固定组织； 振动切片机切振动切片机切303050um50um厚片；厚片； 入正常羊血清入正常羊血清(5(51010，PBSPBS稀释稀释) )室温孵育室温孵育30min30min。 加一抗，加一抗，44湿盒中湿盒中484872h72h。 加二抗，室温孵育加二抗，室温孵育30min30min。 PAP PAP复合物复合物( (与一抗同种属动物制备与一抗同种属动物制备) )室温孵育室温孵育30min30min。 H H2 2O O2 2DABDAB，室温作用，室温作用15min15min。 光镜下选出阳性部位，修整后按常规电镜程序，四氧化光镜下选出阳性部位，修整后按常规电镜程序，

37、四氧化 锇后固定、脱水、包埋、超薄切片、观察。锇后固定、脱水、包埋、超薄切片、观察。（4 4）包埋后）包埋后PAPPAP法：法： 载有超薄切片的镍网入载有超薄切片的镍网入5 5H H2 2O O2 2液内蚀刻，生理盐水洗，液内蚀刻，生理盐水洗， 滤纸吸干。滤纸吸干。 5 5正常羊血清，室温正常羊血清，室温5min5min。 加一抗加一抗) )，44孵育孵育48h48h，TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室温正常羊血清，室温5min5min。 加二抗室温加二抗室温5min5min，后用，后用TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室温正常羊血清，室温5min5min。 加加PAPPAP复合

38、物室温复合物室温3min3min。 H H2 2O O2 2一一DABDAB显色，室温显色，室温3min3min。 入入1 1四氧化锇液四氧化锇液101015min15min后，蒸馏水洗，电镜观察。后，蒸馏水洗，电镜观察。（5 5）PAPPAP免疫电镜双重标记：免疫电镜双重标记：连续超薄切片上进行，用包埋后染色法在相邻的两张切片上分别以不同连续超薄切片上进行，用包埋后染色法在相邻的两张切片上分别以不同的抗体进行免疫染色。可在超微结构水平判定细胞内抗原共存的情况。的抗体进行免疫染色。可在超微结构水平判定细胞内抗原共存的情况。（三）胶体金标记免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术v1971197

39、1年首创胶体金标记免疫电镜技术。年首创胶体金标记免疫电镜技术。v胶体金在碱性环境中带负电，使其与抗体相吸附，从而标记抗体；胶体金在碱性环境中带负电，使其与抗体相吸附，从而标记抗体；v金标抗体与抗原反应时，在光镜胶体金液呈樱红色，不需另外染色；金标抗体与抗原反应时，在光镜胶体金液呈樱红色，不需另外染色；v电镜下，胶体金颗粒，具有高电子密度，清晰可辨；在电镜比铁蛋白颗电镜下，胶体金颗粒，具有高电子密度，清晰可辨；在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物；定位粒更致密，易于辨认，可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物；定位比酶反应物精确。比酶反应物精确。v胶体金容易和多

40、种大分子物质、包括抗体、胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A A蛋白、凝集素等结合。根蛋白、凝集素等结合。根据制备方法不同，可以得到直径在据制备方法不同，可以得到直径在3-150nm3-150nm之间的各种大小的胶体金颗之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同- -标本片上标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。 原理：原理： 胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附，胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附，从而标记抗体。用金

41、标记的抗体与抗原反应时，光镜观察从而标记抗体。用金标记的抗体与抗原反应时，光镜观察呈樱红色。由于金颗粒具有很高的电子密度，电镜观察清呈樱红色。由于金颗粒具有很高的电子密度，电镜观察清晰可辨。晰可辨。 金颗粒可分为三种，小颗粒直径金颗粒可分为三种，小颗粒直径3 35nm5nm，中颗粒，中颗粒10nm10nm，大，大颗粒颗粒20nm20nm。胶体金可标记许多大分子，最常用的是蛋白。胶体金可标记许多大分子，最常用的是蛋白A A一金和一金和IgIg一金。可以利用不同直径的金颗粒标记不同抗体一金。可以利用不同直径的金颗粒标记不同抗体研究不同物质共存于同一细胞组织；也可以与研究不同物质共存于同一细胞组织；

42、也可以与PAPPAP法相结法相结合进行双重或多重超微结构定位。合进行双重或多重超微结构定位。 方法：方法：1 1 电镜水平的免疫金染色法电镜水平的免疫金染色法包埋前染色：胶体金对质膜的穿透力较差，只用于细胞表面的抗原标记。包埋前染色：胶体金对质膜的穿透力较差，只用于细胞表面的抗原标记。包埋后染色：现在普遍采用。包埋后染色：现在普遍采用。（1 1）包埋后染色：）包埋后染色：超薄切片置于镍网上超薄切片置于镍网上 1 1H H2 2O O2 2液内蚀刻，双蒸水洗涤液内蚀刻，双蒸水洗涤3 3次次浮于正常羊血清滴上，室温浮于正常羊血清滴上，室温30-60min30-60min；孵育于一抗上，孵育于一抗上

43、， ，44过夜，过夜，PBSPBS水洗；水洗；PBSPBS（内含（内含1%1%的牛血清白蛋白）的牛血清白蛋白）PH8.2PH8.2，5min5min，为胶体金结合做准备；，为胶体金结合做准备；胶体金标记抗体液，室温孵育胶体金标记抗体液，室温孵育10min-1h10min-1h，双蒸水洗涤；，双蒸水洗涤；如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤；如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤；醋酸铀染色醋酸铀染色5min5min，双蒸水洗涤，枸橼酸铀染色，双蒸水洗涤，枸橼酸铀染色5min5min，双蒸水洗涤；，双蒸水洗涤；电镜观察电镜观察（2 2）包埋前染色

44、：）包埋前染色：组织经适当固定，为增强细胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；组织经适当固定，为增强细胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；TBSTBS洗涤；洗涤；正常羊血清处理；正常羊血清处理；一抗孵育，一抗孵育， 44过夜，过夜，0.05mol/L TBS0.05mol/L TBS水洗；水洗； 0.02mol/L TBS 0.02mol/L TBS水洗，为胶体金结合做准备；水洗，为胶体金结合做准备；正常羊血清再次阻断非特异性吸附；正常羊血清再次阻断非特异性吸附； 金标二抗体液，室温孵育金标二抗体液，室温孵育1h1h，TBSTBS水洗；水洗；1%1%锇酸锇酸1h1h，双蒸水洗，双蒸水洗15min15min；系列酒精或丙酮脱水、包埋、超薄切片；系列酒精或丙酮脱水、包埋、超薄切片；枸橼酸铅对照染色枸橼酸铅对照染色2 2 胶体金标记蛋白胶体金标记蛋白A A技术（技术（PAgPAg法）法）在免疫电镜中应用较为广泛。在免疫电镜