地中海贫血的分子基础及产前诊断-徐湘民

1、 和和 地中海贫血的分子基础地中海贫血的分子基础及产前诊断及产前诊断 徐湘民徐湘民南方医科大学，医学遗传学教研室南方医科大学，医学遗传学教研室南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心遗传性血红蛋白病遗传性血红蛋白病Genetic disorders of human hemoglobin 异常血红蛋白异常血红蛋白 Abnormal hemoglobin, Structural variants 地中海贫血地中海贫血 (地贫地贫) 遗传性持续性胎儿血红蛋白遗传性持续性胎儿血红蛋白 Hereditary persistence of fetal hemoglobin

2、(HPFH)Thalassemia地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方不同高发地中国南方不同高发地区人群携带率区人群携带率 1 23%研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景全球血红蛋白病人群负荷全球血红蛋白病人群负荷WHOWHO地区地区人口人口( (百万百万) )出生出生( (百万百万) )纯合子出生纯合子出生( (千千) )非洲非洲65030.0230美洲美洲73017.55.0亚洲亚洲315084.0120.0欧洲欧洲78011.01.6大洋洲大洋洲300.50.2合计合计5340143.0356.8中国南方地中海贫血人群携带率中国

3、南方地中海贫血人群携带率 地区地区携带率携带率(%)(%) 地贫地贫 地贫地贫 广东广东 8.53 2.54 广西广西 14.95 6.78 四川四川 1.92 2.18 台湾台湾 4.20 1.10 香港香港 5.02 3.41Xu, et al. J Clin Pathol 2004, 57:517-22. Cai, et al. Chi J Epidemiol 2002,23:281-5. 排序排序出生缺陷分析出生缺陷分析例数例数发生频率发生频率(/(/万万) )1先天性心脏病先天性心脏病26019.662重型重型 地贫地贫 20815.733多指多指20015.124肢体短缩肢体短缩1

4、11 8.395唇裂唇裂 / 腭裂腭裂109 8.24广州市主要出生缺陷的发生率广州市主要出生缺陷的发生率 (1998-2001) Pedigree for -thalassemia in a typical family. 地中海贫血地中海贫血: : 常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病地贫是严重致死地贫是严重致死、致残性遗传性血液病致残性遗传性血液病 常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病 受累基因：受累基因： 突变纯合子：突变纯合子： 病理学基础：病理学基础： / /链比例失衡链比例失衡地贫纯合子：致死性出生缺陷地贫纯合子：致死性出生缺陷重型重型 地贫地贫:胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 早

5、产死胎或出生前后死亡早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症可导致严重产科并发症 无理想治疗方法无理想治疗方法重型重型 地贫地贫 出生后出生后1 1年内发病年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持输血和去铁治疗可维持, ,代价昂贵代价昂贵家系样品采集现场家系样品采集现场研究地中海贫血的意义研究地中海贫血的意义 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病优先推荐在发展中国

6、家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景中国需要解决的研究主题中国需要解决的研究主题 发展用于临床和预防的分子诊断技术发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防开展人群水平的地中海贫血预防指导制定计划指导制定计划大人群监控和预防大人群监控和预防 诊断诊断 筛查筛查 预防预防地中海贫血的研究策略地中海贫血的研究策略研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景遗传流行病学调查遗传流行病学

7、调查建立一系列诊断标准和诊断技术建立一系列诊断标准和诊断技术地中海贫血的临床特征地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血小细胞低色素性溶血型贫血( (中、重度中、重度) )黄疸黄疸肝脾肿大肝脾肿大 ( (脾大明显脾大明显) )骨髓扩增骨髓扩增发育迟缓发育迟缓合并感染合并感染Barts Barts 水肿胎水肿胎(地贫地贫, ,宫内或出生后半小时内死亡宫内或出生后半小时内死亡) )地中海贫血的血液学表型特征地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数参数 MCV MCH 细胞形态变化细胞形态变化 Hb电泳分析电泳分析 Hb A2 ( ) 或或 ( ) Hb Barts Hb H ( ) Hb E

8、( ) 地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症血红蛋白电泳图谱血红蛋白电泳图谱1 2 3 4 51. 正常人正常人HB2. 轻型轻型 地贫地贫 3. 异常异常HB E 杂合子杂合子4. 新生儿新生儿HB Barts ( 地贫标准型地贫标准型）5. HB HNormal AA2 AE Barts AF HA+ +- -500V, 25min地贫地贫发生的发生的分子病理学经典机制分子病理学经典机制 地贫地贫: : 基因缺失使基因功能丢失基因缺失使基因功能丢失 地贫地贫: : 结构基因变异使结构基因变异使转录异常转录异常

9、-50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失 Globin genes affected by thalassemia deletionSilent carrierThalassemia traitHb H diseaseHydrops fetalisNormal 地贫疾病严重程度的单倍型顺序 2 1T 2 1 2T 1 1T Hematological data of the proposituse and her

10、 family members. 121 234512Jia SQ, et al. J Clin Pathol, 2004; 57:164-7. Different point mutations reducing globin gene expression EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Rund. & Rachmilewitz. N. Engl. J. Med. 2005, 353:1135-46. 世界上不同种族的常见世界上不同种族的常见地贫突变地贫突变类型类型 种种 族族 突变类型突变类型 地中海人地中海人 IVS-1, position 110

11、(G A) CD39, nonsense (CAG TAG) IVS-1, position 1 (G A) IVS-2, position 745 (C G) IVS-1, position 6 (T C) IVS-2, position 1 (G A)黑人黑人 29, (A G); 88, (C T) Poly(A), (AATAAA AACAAA) 东南亚人东南亚人,中国人中国人 CD 41-42, Frameshift ( CTTT) IVS-2, position 654 (C T) 28, (A G); Hb E (G A) CD17, nonsense (AAG TAG) IVS

12、-1, position 5 (G C)亚洲印地安人亚洲印地安人 IVS-1, position 5 (G C) 619-bp deletion CD 8-9, Frameshift (+G) IVS-1, position 1 (G T) CD 41-42, Frameshift ( CTTT)Results of blood analysis, DNA diagnosis and Results of blood analysis, DNA diagnosis and mRNA detection in the family members.mRNA detection in the fa

13、mily members.Sequencing of the -globin gene amplified from the probandHeterozygosityHeterozygosity for the C for the CT substitution T substitution at position-90 of the-globinat position-90 of the-globin gene gene近年来发现的部分中国南方新突变近年来发现的部分中国南方新突变基基 因因 突突 变变珠蛋白基因珠蛋白基因 11.111.1大片段缺失大片段缺失珠蛋白基因珠蛋白基因 2 2CD

14、118(+TCA)CD118(+TCA)珠蛋白基因珠蛋白基因 90(CT90(CT珠蛋白基因珠蛋白基因 73(AT)73(AT)珠蛋白基因珠蛋白基因 28(AC)28(AC)珠蛋白基因珠蛋白基因CDs15/16(+G)CDs15/16(+G)珠蛋白基因珠蛋白基因 CD38(CD38( A) A) 地中海贫血的产前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的诊断 -地贫的诊断地贫的诊断羊膜穿刺羊膜穿刺 (amniocentesis) 抽取胎儿样品示意图抽取胎儿样品示意图 植入前基因诊断植入前基因诊断 Preimplantation genetic

15、 diagnosis(PGD) 超声产前诊断超声产前诊断 Prenatal diagnosis: Ultrasound measurement 母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断 Prenatal diagnosis: Fetal cells in the maternal circulation 母体血浆或血清中胎儿母体血浆或血清中胎儿DNA分析分析 Analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum目前及今后的胎儿产前诊断新技术目前及今后的胎儿产前诊断新技术Ding C, Chiu RW, Lau TK,

16、Leung TN, Chan LC, Chan AY, Charoenkwan P, Ng IS, Law HY, Ma ES, Xu X, Wanapirak C, Sanguansermsri T, Liao C, Ai MA, Chui DH, Cantor CR, Lo YM. MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids: Application to noninvasive prenatal diagnosis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 20;1

17、01(29):10762-7. 单碱基延伸产物的质谱分析单碱基延伸产物的质谱分析M FF父亲的突变类型父亲的突变类型SABER:single allele base extension reaction 分子量分子量FMStandard protocol SABER protocol在母血浆在母血浆DNADNA中中排除排除父亲的父亲的地贫突变地贫突变+双亲基因型不同：双亲基因型不同：Case CD 41/42 - CTTT IVS2 654 C T nt 28 A G CD 17A T Standard protocol SABER Fetal genotypeWeeks gestation

18、1 F M N / N11 2 F M N / N18 3 F M N / N21 4 M F F / N18 5 M F F / M 17 6 F M F / N11 7 F M F / N14 8 F N / N7 9 F F / N12 10 M F N / N17 11 F F / N20 12 M & F N.A. N.A. N / N18 鉴定母血浆鉴定母血浆DNA中的父亲中的父亲地贫突变地贫突变单倍型分析用于鉴定母血浆单倍型分析用于鉴定母血浆DNA中的父亲等位基因中的父亲等位基因Case Mother Father HBB mutant allele HBB WT all

19、ele SNP G allele Paternal HBB mutation Fetal HBB genotype3 CC GC G C N / N11 CC GC G C F / N12 CC GC G C N.A. N / N地中海贫血的产前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的诊断 -地贫的诊断地贫的诊断DNA诊断技术诊断技术 多重多重PCR （multiplex PCR） 等位基因特异性性寡核苷酸杂交等位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO） 反向点杂交反向点杂交 （RDB） 变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLC） 基于基于

20、微孔板微孔板 (microtiter well-based ) 高通量检测高通量检测 实时实时PCR (real-time PCR) -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失Location of primers and detection of -SEA deletion by gap-PCRGenotyping of the-SEA alleles by Gap-PCR Chong SS, et al. Bl

21、ood. 2000; 95(1):360-2. 寡核苷酸探针杂交技术寡核苷酸探针杂交技术ASOASO探针检测探针检测 - -地贫基因诊断结果地贫基因诊断结果 PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetectionStreptavidin-PODColor Signal MMembraneASON M N M N MSubstrate(TMB)反反向向点点杂杂交交技技术术RDB analysis: application to rapid prenatal diagnosisRDB analysis: application to rapid prenatal diagnosis

22、for eight for eight thalassaemiathalassaemia mutations. mutations.GenotypeFather CDs41-42 ( CTTT) / N MotherIVS-2-654 (C T) / N FetusCDs41-42 / IVS-2-654Normal control N / N Human Human -globin gene and the PCR amplicons -globin gene and the PCR amplicons 5UTREXON 1IVS 1EXON 2IVS 2 IVS2EXON 33UTRFA(

23、453bp)FB(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17 cd26,cd27-28 IVS1-1,IVS1-5 cd37,cd38 cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-666FragmentMutation patternsNormal patternsTotalMutationMutation + SNPHeterozygousHomozygousFA12221237FB 5152224FC 0 322 7Total1740566868 uniquel

24、y profiled DHPLC patterns observed from 795 DNA samples实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果中国南方中国南方 和和地中海贫血的预防计划地中海贫血的预防计划人群筛查预防计划的策略人群筛查预防计划的策略 医院水平医院水平(Hospital-based)(Hospital-based)的预防计划的预防计划 社区水平社区水平(community-based)(community-based)的预防计划的预防计划 家系扩展筛查家系扩展筛查(screening extended families)(scree

25、ning extended families)Carrier screening for and thalassemia in pregnancy: the results of an 11-year prospective program in Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Liao C Li J Huang YN Li QM Feng Q Zhong HZ Cui YYSouthern Medical University Mo QH Li LY Hua L

26、 Zhang JZ Zeng R Jia SQ Xu XMPrenat Diagn 2004, 25:163-71地贫携带者筛查及产前诊断流程地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象被检对象（婚前或孕中期）（婚前或孕中期）血液学分析血液学分析（MCV ，Hb A2变化）变化）排除地贫排除地贫地贫携带者地贫携带者遗传咨询，配偶检查遗传咨询，配偶检查血液学分析血液学分析（MCV Hb A2变化）变化）地贫携带者地贫携带者排除地贫排除地贫遗传咨询遗传咨询双亲基因分析双亲基因分析胎儿产前诊断胎儿产前诊断Outcomes of screening program in GZMNH 1993-2003 Total49221 860758 4503 2804 (5.7) 1783 (3.6) 198 (4.4) 83 (1.8) 131 (2.9) 187 (95.8) 82 (98.8) ( contd )Prenatal diagnosis in 83 fetuses at-risk for thalassemia ( contd )Results in 266 pregnancies where a prec