蛋白质的纯化与鉴定-2p

1、Advanced Biochemistry Fall 20143/28/202223/28/20224GF v03 Aug 20005I. Gel FiltrationChromatography （GFC）n凝胶过滤 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959)n分子筛层析（molecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)n排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen, 1962) 指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。

2、 Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.GF v03 Aug 20007 基本原理 凝胶层析的数理关系 凝胶层析的优点 凝胶层析的缺点 凝胶介质 凝胶类型的选择 其它条件选择固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应 分子大小不同分子大小不同, ,在凝胶受到的在凝胶受到的阻滞作用有差阻滞作用有差异异, ,从而造成各从而造成各组分在凝胶柱组分在凝胶柱中的迁移速度中的迁移速度不同得到分不同得到分离。10

3、M - LMW markers1 - Start material2 - Pool from ion exchange3 - Pool from HIC4 - Pool from Superdex 75 pg4321MM67k43k30kHighly efficient desalting in less than 1 minute 10 20 30 40 50 secAlbuminNaCl柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水外面空隙之间的水相体积，相应于一相体积，相应于一般层析法中流动相般层析法中流动相的体积。的体积

4、。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从干凝的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水胶颗粒重量和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。外间隙体积的总和。 VT = 1/4 D2h 外水体积外水体积V0V VT T = Vg + V= Vg + V0 0 + Vi+ Vi数理关系数理关系Void volume VoVolume of the gel matrix VgPore volume ViGF v03 Aug 2000VoVeVolumeConcentration Ve -VoVe -Vo Kd = Kd = Vi Vi分配系数（分配系数（ K

5、d ）：）：特点：特点：（1）与被分离物质分）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细）与柱的长短粗细无关无关 Kd is difficult to get because Vi is difficult to measure(3)Ve = Vo + Vi(3)Ve = Vo + Vi Kd = 1 Kd = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内完全向凝胶颗粒内部扩散部扩散n在两相分配的比值在两相分配的比值为为1, 1,最后流出最后流出. .(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo Kd = 0 Kd = 0n分子完

6、全被排分子完全被排阻于凝胶颗粒阻于凝胶颗粒之外之外n全部分布于流全部分布于流动相里动相里, ,n最先流出。最先流出。(2) 0 Kd 1 (2) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKdVe = Vo +ViKd为溶质以某种程为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩度向凝胶颗粒内扩散散 2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose，Biogel-A)型号型号 近似的琼脂糖浓度近似的琼脂糖浓度(%)多糖多糖 蛋白质蛋白质 Sepharose 2B 220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106各种层析胶体：Pharmac

7、iaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose六、凝胶类型的选择六、凝胶类型的选择Ixv_2 JB 98091035GF v03 Aug 200036 基本原理 离子交换剂的类型 离子交换剂与缓冲液的选择 应用 离子交换层析的优点低盐高盐分离结束带电荷洗脱树脂与树脂结合力胶体胶体阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性

8、，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯可引入的解离基团可引入的解离基团操作过程：操作过程： 1.装柱； 2.离子交换； 3.洗脱选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择( (三三) )洗脱剂的选择洗脱剂的选择64Af

9、finity chromatography is a technique of liquid chromatography which separates biomolecules through biospecific interactions. 基本原理 分离过程 特点 应用MatrixSpecific ligand凝胶浓度越低凝胶浓度越低结构越疏松即多孔性越高结构越疏松即多孔性越高机械强度越低机械强度越低特点：物理化学性质稳定特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的可供化学反应的KL无效洗脱吸附效率不高有效吸附IV. Hydrophob

10、ic interaction chromatography（HIC）疏水层析疏水层析GF v03 Aug 200085 基本原理 操作 介质的选择 配基的选择 疏水层析的影响因素 疏水层析的优点 疏 水 层 析 亦 称 疏 水 作 用 层 析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，它也属于吸附层析一类, 通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。一、疏水层析的原理一、疏水层析的原理 不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。 在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为

11、Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。（一）疏水作用（一）疏水作用蛋白质与固定相结合原理蛋白质与固定相结合原理蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面子内部的疏水残基暴露至分子表面疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合面的疏水残基容易与疏水性固定相结合洗脱原理洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物

12、质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱）渐洗脱）（二）吸附剂（二）吸附剂根据基质的性质不同分为：根据基质的性质不同分为：1. 1.亲水性吸附剂：亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（糖（SepharoseSepharose）, , 配体有苯基和辛基化合物。二者配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成耦合而成特点：特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统不耐压，一般仅用于常压层析系统2.2

13、.非亲水性吸附剂：非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合价键结合特点：特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如特别适用于高压层析（如HPLCHPLC等）等）二、操作二、操作1. 1.制备层析柱制备层析柱2.2.加样与洗脱加样与洗脱3.3.层析柱再生层析柱再生921. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionEquilibrate the col

14、umn and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules931. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups 941. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteins951. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbs96Conc. saltAbs1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionMore strongly bound proteins偶联至基质的常见配基类型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基 对某些蛋白，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。五、五、