食品毒理学评价

1、食品安全性评价毒性试验n急性毒性试验急性毒性试验n局部毒性试验n蓄积毒性试验蓄积毒性试验n亚慢性和慢性毒性试验慢性毒性试验n遗传毒性n生殖发育毒性急性毒性试验n一次或24小时内多次给予受试物，了解动物所产生的急性毒性反应极其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系。操作步骤操作步骤n健康动物的选择n性别辨认n动物称重、编号和分组n剂量设置n受试物的配制n灌胃n中毒体征和动物死亡情况观察nLD50的计算LD50的计算方法n改进寇氏法改进寇氏法n霍恩法n序贯法序贯法nBliss法改进寇氏法n是利用计量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法，又称平均致死量法。本法要求每

2、个染毒剂量组动物数要相同动物数要相同，各剂量组组距呈等比级数组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率80%。n计算公式如下：nM=Xk-i(p-0.5)nSm=i(pq/n)1/2nM: LD50 i：相邻两剂量组之对数差值nXk：最大剂量的对数值 ；q：存活率np：各组死亡率之和; n:每组动物数组别 剂量对数 动物数 死亡数 n 1.1761 10 0n 1.2561 10 2n 1.3361 10 5n 1.4161 10 71 1.4961 10 9nM=Xk-i(p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）nSm=i(pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0

3、.25/10+0.21/10+0.09/10）1/2霍恩法n利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系而设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法。该法使用动物数少，可直接查表求出LD50 。n该法推荐使用4个染毒剂量，要求每组动物数相等，一般用4-5只动物，且剂量组按等比级数排列。序贯法n又称平均数法、阶梯法或上-下法，先以一个剂量进行实验，若动物死亡，则以下一个较小剂量试探；若动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终求出LD50。nLD50 = (x f)/nnn: 使用的动物总数；X：每个剂量组的剂量nf : 每个剂量组使用动物数n举例：小鼠经口给与某化学物染毒，10mg/kg剂量试探，预计使

4、用4个剂量组，剂量组距对数值0.2，设计使用12只动物，结果如下剂量 存活 死亡12.59 0 210.00 2 37.94 2 26.31 1 0nx f=12.592+105+7.944+6.311该法优点是节省动物，一般12-14只左右动物即可完成实验。缺点？蓄积毒性试验n某些毒物多次以小剂量反复多次以小剂量反复进入体内，可表现出机体对该毒物的反应性增强，即一次染毒不引起反应的剂量，如多次重复染毒，则可能引起明显的反应甚至死亡。n毒物的蓄积与进入机体的毒物剂量、重复染毒的间隔时间、毒性及代谢特点和机体反应特性条件有关。蓄积类型n物质物质蓄积：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能

5、够检测到机体内存在该化学物或代谢产物n功能功能（机能）蓄积：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能检测到机体内存在该化学物或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。功能蓄积可能n是由于机体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检测出物质的蓄积n或者是由于每次机体接触化学物后所引起的损害累积所致蓄积作用的检测方法n应用化学分析或其他技术测定化学物进入机体后在体内含量的变化过程。该方法可确定化学的半衰期n生物学方法：即将一次染毒与多次染毒所产生的生物学效应进行比较，故该法所检测的蓄积性不能区分不能区分功能蓄积和物质蓄积。实验方法n选用大鼠或小鼠经口灌胃或腹腔注射方法进行试验，选用至少40只动物随机分为试验和

6、对照组，雌雄各半。在1/20-1/5 LD50 以相同的染毒途径、定时定量对试验组染毒。n当试验组累积发生一半动物死亡时累积发生一半动物死亡时终止染毒。n另外一种测定毒物蓄积系数的实验方法是动物每天按体重给一定剂量的毒物染毒，第1-4天给0.1 LD50剂量，然后染毒计量按1.5倍每4天递增一次，实验持续20天。蓄积系数nK= LD50n/ LD50n0-1 极强蓄积n1-3 强蓄积n3-5 中等蓄积n5 弱蓄积n LD50：一次染毒50%的致死剂量n LD50n：引起50%动物死亡的累积总剂量n虽然蓄积系数法具有一定使用价值，但是某些化学物的慢性中毒反应无法用K表示n例如多数有机磷化学物有机

7、磷化学物属于轻度蓄积，但以小剂量反复接触后乙酰胆碱酯酶可以持续降低，而且伴有一定程度的中枢神经系统症状亚慢性毒性试验n在急性毒性试验的基础上，进一步研究多次重复染毒条件下出现的中毒体征、生化病理改变以及可能的靶器官，确定是否需要进行慢性试验。试验步骤n试验动物及分组（一般要求选择两种实验动物，实验动物的年龄应较小，动物数80只）n染毒剂量（高剂量组死亡率10%，低剂量组不引起任何中毒反应）n染毒途径n指标观察观察指标n一般综合指标：动物一般行为、体重摄食量变化、中毒体征和死亡情况。n血液及生化检验：常规项目包括血红蛋白、红细胞数、白细胞、血清酶活力等。n脏器重量：如心、肝、肺、肾等n病理学检查

8、：试验结束时结束时处死所有动物处死所有动物进行大体尸检，如未见明显病变，可将高剂量组和对照组的主要脏器进行病理学检查。评价n得出未观察到有害作用的剂量n观察到有害作用的最低剂量n主要中毒体征和毒作用的靶器官结果判定n小于或等于人的可能摄入量的倍者，表示毒性较强，应予以放弃n大于倍而小于倍者，可进行慢性毒性试验 n大于或等于倍者，则不必进行慢性试验，可进行评价 慢性毒性试验n经过长期、反复给予实验动物不同剂量的受试物后，观察慢性毒性效应、严重程度、靶器官和损害的可逆性。操作步骤n分组:3-4个剂量组，1个对照组，每组40-100只，雌雄各半n染毒剂量：根据亚慢性毒性试验NOAEl来确定，以其1/

9、5-1/2为高剂量组，1/50-1/10为中剂量组，1/100为低剂量组。n如无亚慢性毒性试验资料，1/10 LD50为高剂量组，1/100 LD50为中剂量组。n实验期限：6-24个月观察检测指标n一般观察n体重与摄食量测定n临床检查n系统尸检n恢复性观察恢复性观察结果评价与应用n明确阳性指标的意义n分析评价剂量-效应-反应关系n靶器官、毒作用性质nLOAEL、 NOAELn评价慢性毒性大小，为人群长期安全接触水平提供依据结果判定n小于或等于人的可能摄入量的倍者，表示毒性较强，应予放弃。n大于倍而小于倍者，需由有关专家共同评议 n大于或等于倍者，则可考虑允许使用于食品，并制定日许量。如在 任

10、何一个剂量发现有致癌作用，且有剂量反应关系，则需由有关专家共同评议，以 作出评价 实验中应注意的问题n合理营养n对照组对照组n饲料及饮水检查n防止疾病n保证研究结果的实用性保证研究结果的实用性遗传毒性试验n目的：对受试物是否具有改变DNA的可能性进行筛选。 n细菌致突变试验：试验或大肠杆菌试验。 n微核试验和骨髓细胞染色体畸变分析试验中任选一项。 n显性致死试验：睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验和精子畸形试验中任选 一项。 n修复合成试验。 n根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体 外（细胞、微生物）体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则，在以上四类中选择三项试验。 结

11、果判定n如三项试验均为阳性，则无论蓄积毒性如何，均表示受试物很可能具有致 癌作用，一般应予以放弃。n如其中两项试验为阳性，而又有强蓄积性，则一般应予以放弃；如为弱蓄 积性，则由有关专家进行评议，根据受试物的重要性和可能摄入量等，综合权衡利 弊再作出决定。 n如其中一项试验为阳性，则再选择二项其他致突变试验（包括枯草杆菌试 验、体外培养淋巴细胞染色体畸变分析、果蝇隐性致死试验、合成抑制试验 和姐妹染色单体互换试验等）。如此两项均为阳性，则无论蓄积毒性如何，均应予 以放弃；如有一项为阳性，而为弱蓄积性，需进行进一步实验进行验证 。n如三项试验均为阴性，则无论蓄积毒性如何，均可进入进一步的试验。 食

12、品安全性毒理学评价程序 适用范围：n用于食品生产、加工和保藏的化学和生物物质，如食品添加剂，食品加工 用微生物等n食品生产、加工、运输、销售和保藏等过程中产生和污染的有害物质 n 新食物资源及其成份 n食品中其他有害物质 评价总则应全面考虑以下因素，进行综合评价 一、化学结构二、理化性质和纯度 三、人的可能摄入量 四、人体资料 五、动物毒性试验和体外试验资料 n六、代谢试验的资料 n七、综合评价 n八、对任何化学物质的评价都是在一定时间条件下进行的 毒理学评价程序 n本程序包括四个阶段，即急性毒性试验，蓄积毒性和遗传毒性试验，亚慢性毒性 （包括繁殖、致畸）试验和代谢试验，慢性毒性（包括致癌）试

13、验。 n凡属我国创制的新化学物质，一般要求进行四个阶段的试验。特别是对其中化 学结构提示有慢性毒性或致癌作用可能者，产量大、使用面积广、摄入机会多者， 必需进行全部四个阶段的试验。同时，在进行急性毒性、天喂养试验和慢性毒 性（包括致癌）试验时，要求用两种动物。 n凡属与已知物质（指经过安全性评价并允许使用者）的化学结构基本相同的衍 生物，则可根据第一、二、三阶段试验的结果，由有关专家进行评议，决定是否需 要进行第四阶段试验。 n凡属我国仿制的而又具有一定毒性的化学物质，如多数国家已允许使用于食品 ，并有安全性证据，或世界卫生组织已公布每人每日允许摄入量（即，以下 简称日许量）者，同时生产单位又

14、能证明我国产品的理化性质、纯度和杂质成份及 含量均与国外产品一致，则可以先进行第一、二阶段试验。如试验结果与国外相同 产品一致，一般不再继续进行试验，可进行评价。n如评价结果允许用于食品，则制 定日许量。凡在产品质量或试验结果方面与国外资料或产品不一致，则应进行第三 阶段试验。 致畸作用及试验方法n胚胎在发育过程中，由予各种原因造成器官形态结构的异常，称为畸形具有畸形的胚胎或胎仔，称为畸胎。凡能引起胚胎发生畸形的化学物称为致畸物或致畸原。化学物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。广义的致畸作用还包括引起胚胎发育迟缓、还包括引起胚胎发育迟缓、功能不全和胚胎死亡功能不全和胚胎死亡。

15、致畸物n化学致畸物：烷化剂、反应停烷化剂、反应停、激素激素、孕激素、抗代谢物、甲级汞等影响致畸作用的因素n化学物的理化性质n作用时机n剂量n遗传因素n其他因素致畸作用机制n突变引起胚胎发育异常 化学物作用于生殖细胞，引起遗传基因突变所产生的子代畸形具有遗传性，作用于胚胎体细胞引起的畸形是非遗传性的n胚胎细胞代谢障碍 胚胎排除化学物的速度比母体慢，又因胎儿缺乏肝微粒体酶，这致使某些致畸物在胚胎或胎儿期体内的生物转化过程与成人不同，以至于在胚胎内蓄积、造成胚胎中间代谢障碍和能量供应不足影响DNA复制、细胞分裂及组织分化过程而导致畸形n细胞毒性作用 化学致畸物进入胚胎后，表现出细胞毒性作用，引起细胞

16、死亡或细胞增殖抑制，导致这些组织器官畸形n胚胎组织发育过程的不协调 胚胎正常结构的形成、依赖于多种细胞和组织在增殖、分化和生长上的高度协调。某些化学物对胚胎发育过程中的某些细胞或组织增殖分化过程的干扰，可造成各种细胞和组织之间在时间和空间关系上的紊乱，导致特定的组织、器官、系统的发育异常。致畸试验方法n物种选择n剂量与分组n动物交配处理n致畸效应检查物种选择n致畸试验中动物的选择除参照一般毒性试验的原则外，还应选择孕期较短、孕期较短、每窝产仔数较多、胎盘结构和代谢途径每窝产仔数较多、胎盘结构和代谢途径与人类接近与人类接近的动物，其自然畸形发生率要低。一般首选大鼠其次是小鼠或家免。剂量的设置n受

17、试动物分为2-3个剂量组，另设阳性对照组和阴性对照组。先求出成年雌鼠的LD50，以15-13LD50为高剂量组，l100-130 LD50为低剂量组，若实际接触量作为低别量组；并以其10倍左右为高剂量组组动物的交配处理n将性成熟的动物按雌雄1：1或2：1比例同笼交 配，并准确查知其受精日期。为此，每日清晨进行雌性动物雌性动物阴栓脱落阴栓脱落，以确认雌件动物是否受精 阴栓是排鼠精囊与凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，交配后能在雌鼠阴道外部出现。大鼠的阴拴极易脱落，次日可在笼下的载盘中发现。小鼠的阴性不易脱落，在阴道内才能查到。染毒时间的控制n由于致畸作用有明显的有明显的敏感期敏感期，所以给于受试物的时间