蛋白质protein2.1

1、第四节 蛋白质结构与功能的关系（一）肌红蛋白的三级结构（一）肌红蛋白的三级结构组成：珠蛋白和血红素组成：珠蛋白和血红素 大小和形状：扁平状分子，大小和形状：扁平状分子，4.5nm3.5nm2.5nm 结构描述：结构描述：153个氨基酸，个氨基酸，8段段-螺旋组成，分两螺旋组成，分两层，单结构域。分子结构紧密，内部只能容纳层，单结构域。分子结构紧密，内部只能容纳4个水分子的空间。疏水基团在分子的内部，亲个水分子的空间。疏水基团在分子的内部，亲水基团在分子表面，介于疏水和亲水之间的基水基团在分子表面，介于疏水和亲水之间的基团在分子内部和外部都可以找到。团在分子内部和外部都可以找到。 （二）辅基血红

2、素（二）辅基血红素由由4个吡咯环通过甲基桥连接成原卟啉个吡咯环通过甲基桥连接成原卟啉IX，另，另外有外有4个甲基，个甲基，2个乙烯基和个乙烯基和2个丙酸基。原卟个丙酸基。原卟啉啉IX与与Fe形成络合物，即是血红素。形成络合物，即是血红素。Fe有有6个个配位键，其中配位键，其中4个键与卟啉环的个键与卟啉环的4个个N原子相连，原子相连，第第5配位键与配位键与His F8相连，第相连，第6配位键与配位键与O2相连。相连。 如果血红素含如果血红素含Fe2+，则为，则为亚铁血红素亚铁血红素，含，含Fe3+，为，为高铁肌血红素高铁肌血红素。相应的血红蛋白分别。相应的血红蛋白分别为为亚铁血红蛋白亚铁血红蛋白

3、和和高铁肌红蛋白高铁肌红蛋白。（三）（三）O2与肌红蛋白的结合与肌红蛋白的结合 Fe的第六配位键在没有的第六配位键在没有O2时，是空着的，时，是空着的，O2与肌红蛋白中的与肌红蛋白中的Fe 结合，结合以后与结合，结合以后与Fe-O键形成键形成60度的夹角，同时夹在远侧组氨酸的中度的夹角，同时夹在远侧组氨酸的中间。间。 除了除了O2与与Fe结合外，结合外，CO也会与也会与Fe结合，导结合，导致致CO中毒。中毒。 肌红蛋白的微环境的作用：肌红蛋白的微环境的作用： 1.固定血红素；固定血红素； 2.保护血红素保护血红素Fe不被氧化；不被氧化； 3.为分子氧提供一个合适的结合部位。为分子氧提供一个合适

4、的结合部位。O2与血红素与血红素Fe结合后，会改变肌红蛋白的结合后，会改变肌红蛋白的构象。没有结合氧时，铁卟啉处于凸出位置，构象。没有结合氧时，铁卟啉处于凸出位置，并且并且Fe是圆顶状，结合氧后铁卟啉收回形是圆顶状，结合氧后铁卟啉收回形成平面状。成平面状。（四）氧结合曲线（四）氧结合曲线当当Y0.5时，时，P(O2)KP50， P50定义为肌红蛋白定义为肌红蛋白被氧半饱和时的氧分压。被氧半饱和时的氧分压。三、血红蛋白的结构与功能三、血红蛋白的结构与功能 4条多肽链，两个为条多肽链，两个为链，两个链，两个链，每链，每个亚基都有一个血红素分子，具有氧结合能个亚基都有一个血红素分子，具有氧结合能力。

5、力。 人在不同的发育阶段有不同的种类。人在不同的发育阶段有不同的种类。 -链和链和-链的三级结构与肌红蛋白相似。链的三级结构与肌红蛋白相似。 四个亚基形成对称结构。四个亚基形成对称结构。（一）结构（一）结构 （二）氧结合引起的血红蛋白构象变化（二）氧结合引起的血红蛋白构象变化（三）血红蛋白的协同性氧结合（四）（四） H+，CO2和和BPG对血红蛋白对血红蛋白结合氧的影响结合氧的影响Bohr效应：效应： H+、CO2 和和 BPG 是变构效应是变构效应剂，促进从血红蛋白释放氧。剂，促进从血红蛋白释放氧。 H+和和CO2 结结合到多肽链的不同部位，合到多肽链的不同部位， BPG 结合在四个结合在四

6、个亚基之间的中央空穴处。它们的效应是可亚基之间的中央空穴处。它们的效应是可加合的。加合的。 （三）（三） 蛋白质一级结构的突变蛋白质一级结构的突变分子病分子病分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。变，功能部分或全部丧失。镰刀形红细胞贫血现象是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的镰刀形红细胞贫血现象是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的 链第链第6位的位的aa残基由正常的残基由正常的Glu变成了疏水性的变成了

7、疏水性的Val 正常人血红蛋白，正常人血红蛋白，.N.Glu 6镰刀型贫血镰刀型贫血 .N.Val 6生理条件下电荷：生理条件下电荷： Glu- Va10 亲水亲水 疏水疏水 血红蛋白的分子病镰刀状细胞贫血病：镰刀状细胞贫血病：红细胞的形态多为镰刀状，细胞中为非正常血红红细胞的形态多为镰刀状，细胞中为非正常血红蛋白蛋白-HbS 。是基因传递的溶血性疾病。是基因传递的溶血性疾病。 分子基础：分子基础： 链链 上第上第6位位Glu残基（极性）被残基（极性）被Val取代（疏水残基）。取代（疏水残基）。 HbS在每个在每个链的外部有一粘链的外部有一粘性疏水斑。性疏水斑。 免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白

8、（免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。 抗体（抗体（antibody，Ab）是）是B细胞识别抗原后增细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能合，具有免疫功能 。（一）免疫反应的基本概念（一）免疫反应的基本概念 当外源的分子（蛋白或细胞表面分子）进入反应哺当外源的分子（蛋白或细胞表面分子）进入反应哺乳动物体内，与淋巴细胞接触，会产生一种免疫球

9、乳动物体内，与淋巴细胞接触，会产生一种免疫球蛋白，当这种分子再次进入肌体，就会被这种免疫蛋白，当这种分子再次进入肌体，就会被这种免疫球蛋白的识别，并动员相关的免疫系统清除这种分球蛋白的识别，并动员相关的免疫系统清除这种分子（及细胞）。这种外源分子即为抗原；识别这种子（及细胞）。这种外源分子即为抗原；识别这种抗原的免疫球蛋白叫抗体。抗原的免疫球蛋白叫抗体。一个复杂的抗原可以被若干个不同的抗体结合。一个复杂的抗原可以被若干个不同的抗体结合。一个单独的抗体或一个单独的抗体或T细胞受体只能结合抗原内的一个细胞受体只能结合抗原内的一个特定的分子结构，称为它的抗原特定的分子结构，称为它的抗原决定或表位。决

10、定或表位。（三）免疫球蛋白的种类及功能（三）免疫球蛋白的种类及功能 IgG于出生后于出生后3个月开始合成个月开始合成 IgG多为单体，半衰期约为多为单体，半衰期约为23天，占血清免疫球蛋白总量的天，占血清免疫球蛋白总量的75%80% IgG1、IgG2和和IgG3的的CH2能通过经典途径激活补体能通过经典途径激活补体 IgG是唯一能通过胎盘的抗体是唯一能通过胎盘的抗体 通过通过Fc段与吞噬细胞表面段与吞噬细胞表面FcR结合，发挥调理作用；与结合，发挥调理作用；与K细细胞结合，发挥胞结合，发挥ADCC作用；与葡萄球菌作用；与葡萄球菌A蛋白结合。蛋白结合。 具有抗菌、抗毒和抗病毒作用具有抗菌、抗毒

11、和抗病毒作用 参与参与II、III型超敏反应型超敏反应 IgG 为五聚体，是分子量最大的为五聚体，是分子量最大的Ig，称巨球蛋白。，称巨球蛋白。 IgM激活补体能力比激活补体能力比IgG强强 天然血型抗体是天然血型抗体是IgM IgM是个体发育过程最早能产生的抗体，胚胎晚期已能合是个体发育过程最早能产生的抗体，胚胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若成，新生儿脐带血中若IgM水平升高，表示该儿曾有宫内水平升高，表示该儿曾有宫内感染感染 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测IgM水平可用水平可用于传染病的早期诊断于传染病的早期诊断 IgM是是B细胞抗原受体的主要成

12、分细胞抗原受体的主要成分 也可参与也可参与II、III型超敏反应型超敏反应 IgM分为血清型和分泌型两种，血清型分为血清型和分泌型两种，血清型IgA主要由主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型IgA（SIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生。道等处的固有层中浆细胞产生。 主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。 分泌型分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜的合成和主要作用部位在黏膜IgA

13、IgD是是B细胞的重要表面标志细胞的重要表面标志 B细胞的分化过程中首先出现细胞的分化过程中首先出现SmIgM，后，后来出现来出现SmIgD，他的出现标志着，他的出现标志着B细胞成细胞成熟熟了。IgD又称亲细胞抗体又称亲细胞抗体 CH2和和CH3功能区可与肥大细胞、嗜功能区可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力碱性粒细胞上的高亲和力Fc受体结合，受体结合，引起引起I型超敏反应型超敏反应 IgE（四）免疫检测应用五、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩六、蛋白质的结构与功能的进化 生物的形态和分子结构在进化过程中不断向多生物的形态和分子结构在进化过程中不断向多样化和专业化方向发展。这种多样化是指群体

14、的多样化和专业化方向发展。这种多样化是指群体的多样化，专一化是个体的专一化。样化，专一化是个体的专一化。 这种多样化和专一化的基础是分子变异。这种这种多样化和专一化的基础是分子变异。这种变异通过自然选择，进行多样化和专一（业）化。变异通过自然选择，进行多样化和专一（业）化。 核核DNA倍增的基础是倍增的基础是DNA的不完全复制。导致的不完全复制。导致基因的拷贝数增加。基因的拷贝数增加。第五节 蛋白质的分离、纯化和表征（一）蛋白质的酸碱性质（一）蛋白质的酸碱性质 1.蛋白质中的解离基团蛋白质中的解离基团 2.等电点：中性盐（等电点：中性盐（Ca2+、Mg2+、cl-、HPO42+） 影响滴定曲线

15、形状和等电点影响滴定曲线形状和等电点 3.等离子点等离子点（二）蛋白质分子的大小和形状（二）蛋白质分子的大小和形状 蛋白质的大小从蛋白质的大小从60001000000 Dalton 不同的蛋白质常常有不同的分子量；不同的蛋白质常常有不同的分子量； 蛋白质的形状：球状和纤维状，不同的蛋白质的形状：球状和纤维状，不同的蛋白质的长短轴比值也有差异。蛋白质的长短轴比值也有差异。 这些差异也是进行分离纯化的依据。这些差异也是进行分离纯化的依据。测蛋白质相对分子质量的方法：测蛋白质相对分子质量的方法：化学组成法测定最低分子量化学组成法测定最低分子量SDS-PAGE法法凝胶过滤法凝胶过滤法渗透压法渗透压法扩

16、散系数法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法沉降系数法和沉降平衡法1.根据分子组成测定最小分子量根据分子组成测定最小分子量如肌红蛋白含如肌红蛋白含0.335%的铁的铁 Fe分子量分子量 55.8最低最低M Fe(%) = 0.335 =16700 牛血清白蛋白含牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低最低M=35200，实际为，实际为69000，含，含2个个Trp*100 2、 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 p297-2983 .据据pr的渗透压的渗透压 p292用用一半透膜一半透膜将将pr溶液与纯水隔开，当溶液与纯水隔开，当渗透渗透达平衡达平衡时，测定其渗透压，计

17、算分子量：时，测定其渗透压，计算分子量：C：浓度（克：浓度（克/升）升）R：气体常数（：气体常数（0.082升升/大气压大气压/克分子克分子/K开氏温度）开氏温度）T：绝对温度（开氏温度）：绝对温度（开氏温度） ：以大气压表示的渗透压：以大气压表示的渗透压ccTRMr0lim4.SDSPAGE （十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）沉降速度法沉降速度法通过测定沉通过测定沉降界面的移降界面的移动速度测定动速度测定Mr. dx/dt=常数常数沉降系数：沉降系数： 单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用s表示。表示。 s=(dx/

18、dt)/2X=mp(1 - )/f 沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，s与与分子量成正比。因此分子量成正比。因此s常用作生物大分子的大小表示方法。常用作生物大分子的大小表示方法。 由于由于s值较小，因此用值较小，因此用1X10-13表示表示1个沉降系数单位。个沉降系数单位。S值与温值与温度和溶剂有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏度和溶剂有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏20度，度，水溶液条件下的水溶液条件下的s值为标准。值为标准。由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的形状的影响，而形由于蛋白质分子的沉降速度同时受

19、到分子的形状的影响，而形状与其扩散系数有关，所以状与其扩散系数有关，所以 沉降平衡法测定蛋白分子量沉降平衡法测定蛋白分子量离心平衡时，离心平衡时，检测两个切面检测两个切面的浓度差异，的浓度差异，确定蛋白分子确定蛋白分子量。量。dm =dm Mr=(2RTdln c1/c2)/(1- 2三、三、 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达尔中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达尔现象，不能通过半透膜）现象，不能通过半透膜）1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素、稳定蛋白质胶体溶液

20、的主要因素蛋白质表面极性基团形成的水化膜。蛋白质表面极性基团形成的水化膜。非等电状态时，同种电荷的互相排斥。非等电状态时，同种电荷的互相排斥。质点大小在质点大小在1-100nm，可以进行布朗运动。，可以进行布朗运动。蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用2、蛋白质沉淀的方法、蛋白质沉淀的方法 盐析法盐析法: 大量的中

21、性盐大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl，使蛋白，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。质脱去水化层而聚集沉淀。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、丙酮、乙醇等。乙醇等。重金属盐沉淀：重金属盐沉淀：pHpI时带负电荷，与重金属离子（时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀。等）结成不溶性沉淀。生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不

22、溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加热变性沉淀：天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。加热变性沉淀：天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。等电点沉淀法。等电点沉淀法。四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的总目标：纯化的总目标： 增加制品增加制品(preparation)的纯度或比活。的纯度或比活。一般程序：一般程序： 前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存。前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存。 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提

23、取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法（盐析、等电点及有机溶剂等）选择性沉淀法（盐析、等电点及有机溶剂等）亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析1、前处理：、前处理：将组织和细胞破碎将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机（动物组织和细胞：电动捣碎机（waring blender) 匀浆器（匀浆器（homogenizer) 超声波处理（超声波处理（ultrasonication)植物组织和细胞：石英砂植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨提取液，研磨 纤维素酶处理纤维素酶处理细菌：超声

24、波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）（分解肽聚糖）差速离心法收集细胞的某一组分差速离心法收集细胞的某一组分如果提取膜蛋白：如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级（、粗分级（rough fractionation)一般用选择性沉淀法。一般用选择性沉淀法。（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法热处理选择性沉淀法热处理选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法生物碱或三氯乙

25、酸选择性沉淀法3、细分级（、细分级（fine fractionation)透析除盐透析除盐sephdex G-25凝胶过滤除盐凝胶过滤除盐层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳密度梯度离心密度梯度离心4、保存、保存保存方法：保存方法：晶体保存：晶体保存：结晶过程本身也

26、伴随着一定程度的提纯。能否结晶结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。、接入晶种。冻干粉保存：冻干粉保存：溶液保存：溶液保存：加入抗冻剂（加入抗冻剂（50%甘油）后甘油）后-20-70保存。保存。六、六、 分离纯化蛋白质的主要方法分离纯化蛋白质的主要方法根据蛋白质的溶解度分离根据

27、蛋白质的溶解度分离根据电荷差异分离根据电荷差异分离根据分子大小分离根据分子大小分离根据配体特性异性分离（亲和层析）根据配体特性异性分离（亲和层析）选择性吸附分离（物理吸附）选择性吸附分离（物理吸附）根据疏水性的差异根据疏水性的差异 （一）根据溶解度差异的分离：选择性沉（一）根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法淀法 P304-307盐析法盐析法等电点沉淀法等电点沉淀法有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法重金属盐选择性沉淀法（重金属盐选择性沉淀法（pHpI，蛋白质带负，蛋白质带负电荷）电荷）生物碱和酸选择性沉淀法（生物碱和酸选择性沉淀法（pHpI，蛋白质带，蛋白质带正电荷）正电荷）热处理沉淀法（铜锌

28、热处理沉淀法（铜锌SOD，65、15分钟、稳分钟、稳定）定）可否变性可否变性1、等电点沉淀和、等电点沉淀和pH控制控制 P305在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。在在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。2、蛋白质的盐溶与盐析、蛋白质的盐溶与盐析 P305盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度，称盐溶，主要是，称盐溶，主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子

29、间的相白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。互作用却加强，因而溶解度增高。盐析：高盐浓度时，使盐析：高盐浓度时，使pr溶解度溶解度析出，称盐析。析出，称盐析。盐析多用溶解度大的中性盐，如盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液。等的饱和溶液。（二）、根据分子大小和形状的差异：（二）、根据分子大小和形状的差异：P301-304透析和超滤法：除去小分子物质透析和超滤法：除去小分子物质密度梯度离心法密度梯度离心法 凝胶过滤法凝胶过滤法半透膜阻留半透膜阻留pr分子，而分子，而让小的溶质分子和水通让小的溶质分

30、子和水通过，以达到除去蛋白质过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低溶液中小分子（盐、低分子酸等）。分子酸等）。施以一定的压力使小施以一定的压力使小分子溶质通过一半透分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋孔大小截留相应的蛋白质分子。白质分子。沉降的速度与颗粒的沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有重量、密度和形状有关。关。离心后按其沉降离心后按其沉降的速度不同，彼此分的速度不同，彼此分开形成区带。再进行开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰光学定位，针刺或冰冻切片采样分析。冻切片采样分析。蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度交 联 葡 聚 糖交 联 葡 聚 糖（Sephad

31、ex）;聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ，），） 琼 脂 糖 凝 胶琼 脂 糖 凝 胶（Sepharose，Bio-Gel A）柱床体积：柱床体积：Vt=Vo+Vi洗脱体积：洗脱体积：Ve=Vo+kdVi 当当kd=0时时，Ve=Vo，溶质全从，溶质全从Vo出来，出来， 无分配。无分配。当当kd=1时时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但 各物质不能分开。各物质不能分开。当当0kd1时时，Ve=Vo+kdVi，各溶质具有不同分配，得以分各溶质具有不同分配，得以分 离。离。交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex）（三）（三

32、） 根据电荷性质的差异根据电荷性质的差异: P307-3121、电泳和等电聚焦法：、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳。电泳。从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从从装置上分装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。板电泳。从从支持物分支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等），琼脂糖胶，淀粉胶等）等电聚焦电泳法测定蛋白质等电聚焦电泳法测定蛋白质pI2、离子交换层析法：、离子交换层析法：P310离子交换纤维素：离子交换纤维素：离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应离子交换交联琼脂糖：离子交换交联琼脂糖：交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂P310 表7-6 一些常用的纤维素离子交换剂和一些常用的纤维素离子交换剂和sephadex离