婴幼儿配方乳粉中维生素D的检测方法

1、婴幼儿配方乳粉中维生素D的检测方法嬰幼儿配方乳粉中维生素D的检测方法，最常见的是高效液相色谱法，相应的研咒成果较炙，但由于各研究对象的遽异及实验条件的不同，往往实验检测结果具有一定波动性。本论文对婴幼儿配方乳粉中维生養D测定方法进行了改进，将乳粉样品与脂肪酶*碱液混合*经过低温皂化后用超高效液相色谱仪测定争结果表明，379条件下，乳粉样品皂化充分，使用石油醛多次萃取后定容进超高效液相色谱仪检测，以甲醇-水973,V:V）为流动相，最终可在】。分钟之内将维生索D充分分离.最终检出限为0.2Hg/IO0g.利用此方法对婴幼儿配方乳粉中的维生素D含量进行检测，分析结果良好，为实际生产检验中维生索D的

2、确定和质虽分数控制提供了更为有效的方法口婴幼儿配方乳粉产品中錐生素D添加形式为维生素Da本论文将主要研呢维生薰6的雑体総定性特性.实验所用仪器及试剂分别见表2.1利表2.2表2.】实验仪器衙息Table2JExperimentinstnimcnts仪番生产商Agilent1290超商效液相色谱牧美国Agilent科技有限公司二极管阵列检测器，自动进祥器売国Agiknt科技有限公司电热恒温振荡水槽上悔一恒科技有陨公司FA20Q4电子天平上海方瑞仪器有限公司EyelaSB-1100转蒸发仪日本东康理化器械株式会社Milli'QElement超纯水机美国密理博公司C18&相色锻柱(l

3、.t|idU.XOOnw)上海安谐科学仪器有限公司袈2.2实骏试剂及材料Table2.2ReagentandMaterials试剂规格生产商脂肪詡(CandidarugosaLipase)1468U/mg羌国supelco公司无水乙醇分析纯天津永大化学试剂有限公司石油18(沸程30-60-C)分析纯天津永大化学试剂有限公可无水硫酸钠分析纯天津永大化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯灭津永大化学试剂有限公旬抗坏血酸分析纯天津永大化学试剂有限公同甲醇色谱纯德国CNWTechnologiesGmbH公司维生素D2、维生素D>99%烫国supelco公司实验所用水均为电阻率M18.2MQCm的超纯水，

4、另配制10g/L的抗坏血酸乙醇溶液；浓度为0.Olmol/mL的KOH溶液。随机选择市场内销售乳粉品牌的婴幼儿I段配方乳粉，其维生素6标示含就值为9.6gg/100g.实验方法2.2.2.1维生素D标准液配制准确称取10mg维生素Ds，用乙醇溶解并定容至lOOmL棕色容星瓶，制备成质量浓度为100mg/L维生素6标准储备液（冷冻储藏，保质期3个月）。222.2样品前期处理准确称取lO.Og乳粉样品（精确到O.lg）于250mL的三角瓶中.加入1.5g脂肪酶及20mL温水充分摇匀溶解，继续加入80mL抗坏血酸乙醇溶液及20mL的KOH溶液混匀，之后充入氮气将空气排出，密封后置于（37±

5、1）9下均匀振荡4小时（120r/min）.酶解后取出三角瓶并快速降温，将得到的酶解皂化液避光转入250mL分液漏斗中，原三角瓶使用石油瞇多次少量淋洗后，淋洗液同样并入分液漏斗中。向分浊漏斗中缓慢加入石油醛lOOmL,均匀振荡后静置，将下层水相转入另一同规格分液漏斗中，按之前方法再次进行萃取。萃取结束后合并萃取液，加水多次洗至中性。加入5g无水硫酸钠固体为石油港萃取液脱水，之后将萃取倒入500mL圆底烧瓶中，放入旋转蒸发器在35t的抽真空条件下进行蒸发脱水，至近干状态。残渣用甲醇溶液溶解3次，溶解液合并后定容于10mL棕色容量瓶.准确移取此甲醇溶解液5mL,使用氮吹仪在35C条件下吹干，之后加

6、入ImL甲醇溶液溶解残渣，溶液用0.22屮n滤膜过滤后，进入超高效液相色谱仪进行测定分析。色谱条件色谱柱：AgilentEclipseplus.l.8pm,2.1X100mmC)g反相色谱柱；流动相为甲醇-水(97:3,V:V)；流速O.lmL/min；检测波长264nm；进样体积为10pL。2.3结果与讨论色谱条件选择流动相体积比根据已有研究"】，反相液相色谱测定维生素d的流动相主要为甲醇。在实验过程中发现，如果单纯使用甲醇作为流动相，所有物质出峰时间提前，峰形有所重叠，分离效果不好。加入一定比例水作为流动相后，出峰时间有所延长，实验详细比较了甲醇水流动相比例分别为95：5,97：

7、3和100：1时的出峰情况，结果如图2.1所示.实验结果表明，当甲醇水比例达到97：3时，标准品峰形良好，样品中维生素D峰与其他干扰物达到较好的分离，没有杂峰干扰.因此，选择甲醇和水的体积比例为97：3作为流动相最佳组成比例。a)甲醇：水-95：523456789t(mm)b)甲醇：水=97：3c）甲醇：水-100：1图2.1不同甲薛水液动相比例时的色谱图Fig2.1Chromatogramsofdifferentmethanolwaproportions流动相流速由于超高效液相色谱使用1.8Pm,2.1X100mmCw反相色谱柱，长度较短，因此对流速有一定限制，流速过高时柱压过大，分离效果会

8、受到影响同时对色谱柱也有损害。一般最大流速为0,2mL/min.实验中选取0.2,0.15和0.1mL/min分别进行实验,见图22由图2.2可以看出，流速在0.2mL/min时，维生素D峰形与杂质有所重叠,无法完全分离，流速为0.15mL/min时也有类似情况，基线发生漂移.只有流速在O.lmL/min时峰形完整，与其他杂质分离较好.因此，选取O.lmL/min作为流动相流速。11星£234567Kmin)89a)流速为02mL/min23456789t(min)b)流速为0.15mL/min1234.567-89t(nnn)c)流速为O.lmL/min图2.2不同流速条件下的色谱

9、图Fig2.2Chromatogramsofdifferentflowingrates色谱柱温度由于每次测定过程时间很短，色谱柱温度整体来看对检测结果影响不大，分别在30,40和509色谱柱温度条件进行实验，整体无明显差异，出于保护色谱柱的考虫,选取309作为色谱柱温度。因此，实验获得的超高效液相色谱二极管阵列检时的最佳色谱分离条件为，流动相比例甲醇-水(97:3,V/V),流速O.lmL/min,柱覷30C,进样体积10pL。标准色谱图，线性回归分析及检出限在最佳色谱分离条件下对维生素D标准品和婴幼儿配方乳粉样品进行了检测，见图2.3标准品和样品在lOmin内均得到了完全分离一天内将同一乳粉

10、样品连续进行6次色谱分析，目标物迁移时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)见表2.3,迁移时间和峰面积都显示了较好的重现性。依次取0.2,0.5,1,2,5mL及10mL维生素D标准储备液于6个100mL棕色容量瓶，各自用乙醇定容，制成质量浓度为0.2,0.5,1,2,5mg/L和10mg/L的维生素D系列标准工作液。直接进超高效液相检测，以得到的峰面积为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图2.4所示。得到的标准品回归方程、线性范围及检出限见表2.4.实验可知,此方法下测定维生素D的检出限为0.2鸠/100g,与同类方法相比灵敏度较高。表2.3劇现性实验Table2.3Preci

11、sionexperiment序号123456RSD(%»n=6)测定值(lU/100g)2712802752822772741.45表2.4线性范围、回归方程及检出限Table2.4Calibrationrange,regressionequationsanddetectionlimit回归方程相关系数2线性范围检岀限y-156.28x15.1780.99950.2-10mg/L02n”100g12345679t（min）a）标准品色谱图Fig2.3Chromatogramsofstandardsubstancesandsample02468标准品质童浓度（®gLl）(S.

12、AOI)123456789t(mn)b)样品色谱图图23标准品和样品色谱图1012图2.4维生素D标准曲线Fig2.4StandardcurveofvitaminD将己知含量的维生素D标准品加入婴幼儿配方乳粉样品中，同时称取乳粉空白平行样.将所有样品按上述方法进行前处理及后续测定，结果折算为IU/100g(1IU维生素D=O.O25pg维生素D)结果如表2.5所示。表2.5加标回收率实验Table2.5Recoveriesofsampleswithstandardsubstances样品号平均本底测定值/(lU/100g)添加值/(IU/100g)测定值/(IU/100g)回收耶/(%)平均回

13、收率/(%)128463893.3228940064693.893.4327963293.24281103095.35276800102895.695.36288103395.07291144196.782851200143796.896.59288142996.1实验表明，该方法测定婴幼儿配方乳粉中维生素D含量，回收率范围在93.4沧96.5%,可用于实际分析检测。2.4结论.(1) 本文改变了乳粉皂化的的期处理步骤，利用脂肪酶配合碱性溶液将样品进行了酶解，同时在低温皂化条件下将样品进行了预处理，尽可能的减少了维生素D的损失，提高了检测回收率，同时省去了传统方法中正相纯化步骤，缩短了检测时间.实验中发现，适当延长皂化时间及提高皂化温度，有助于最终峰形分离，但超过5h之后无明显变化，且温度过高脂肪酶可能失活。因此最终确定37C振摇5h皂化。(2) 本文采用97:3的甲醇水流动相，流动相流速为O.lmL/min,色谱柱温度为30*