第18章色谱法导论

1、第第18章章 色谱法导论色谱法导论18.1. 概论概论18.1.1. 分离科学的形成分离科学的形成1.蒸馏器与蒸馏设备2.沉淀、结晶、电解、萃取等分离技术 3.精馏、区域熔炼等 4.色谱与电泳18.1.2. 分离与色谱法分离与色谱法 分离（separation）是一种假定的（hypothetical）状态，在这种状态下，物质完全被分开（isolation），就是说，含有n种化学组分的混合物被分成n种纯的形式，并把它们置于n个独立容器中。 困难：一是被分离组分在分离过程中再混合；二是被分离组分的浓度稀释或分子离散。 色谱分离是基于混合物各组分在两相中分布系数的差异，当两相作相对移动时，被分离物质

2、在两相间进行连续、多次分配，组分分配系数微小差异导致迁移速率差异，实现组分分离。 dcbadcba18.1.2. 分离与色谱法分离与色谱法 分析分离常在极微小体系内完成，如毛细管、芯片式的微通道。 分离分析的微型化，即微分离（microseparation）技术是当前的发展趋势之一。 色谱亦是高效制备分离方法。与分析分离相比，制备分离处理的样品或物料量要大得多，其目的也不尽相同。按分离目的和处理物料量可分为小规模实验室制备分离和大规模工业制备分离。 经典柱色谱、制备色谱、萃取、精馏、结晶 精馏、萃取、吸附、吸收、膜分离18.1.3. 分离方法分类分离方法分类. 按相的类型分类1

3、8.1.3. 分离方法分类分离方法分类. 按分离机理分类18.1.3. 分离方法分类分离方法分类.按分离过程推动力分类18.1.4.色谱法分类色谱法分类. 按固定相的形态分类柱色谱：填充柱、整体柱、毛细管或开管柱平面色谱：薄层色谱和纸色谱. 按色谱动力学过程分类淋洗色谱法置换色谱法迎头色谱法18.1.4.色谱法分类色谱法分类.按两相的物理形态、分离机理等分类18.1.5.色谱法与其他分离、分析方法比较色谱法与其他分离、分析方法比较.与精馏、萃取分离比较1. 色谱、精馏与萃取同属平衡分离方法。2. 色

4、谱法与精馏、萃取分离比较具有速度快、效率和选择性高的特点。3. 精馏不能分离沸点相同的组分，萃取不能分离在溶剂中溶解度相同的组分；色谱法可分离沸点、溶解度相同的组分，可分离物理、化学性质相近，其他分离方法不能或难以分离的组分。 4. 精馏、萃取可分离物理化学性质差别较大的组分，仪器分析色谱法每次处理样品量少。 5. 多级萃取和色谱法分离过程中分离组分被稀释。18.1.5.色谱法与其他分离、分析方法比较色谱法与其他分离、分析方法比较.与化学分析方法比较1. 不受化学性质限制，是一种分离分析方法。2. 化学分析本身不具备分离功能，简单、快速。3. 化学分析一般不适用于分析多组分的混

5、合物。 4. 化学分析定量方法简易；色谱法定量测定较复杂。 18.1.5.色谱法与其他分离、分析方法比较色谱法与其他分离、分析方法比较.与光谱、质谱分析方法比较1. 光谱、质谱主要是物质定性鉴定分析方法，色谱法本质上不具备定性分析功能。2. 色谱法最主要的特点是适用于多组分复杂混合物分离分析。 3. 色谱仪器的价格相对比分子光谱、质谱仪器低得多，适用范围和领域更广。 4. 一般来说色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。 18.2色谱法基础知识、基本概念和术语色谱法基础知识、基本概念和术语18.2.1 色谱分离和相应基础理论范畴 色谱基础理论是从微观分子运动和宏观分布

6、平衡探讨最大限度提高分离迁移和降低离散迁移的科学原理，包括色谱热力学、色谱动力学和色谱分离理论。 各种色谱方法具有基本相同的动力学理论，也有相似的分离理论规律。 18.2.2 分布平衡分布平衡色谱过程涉及溶质在两相中的分布平衡(distribution equilibrium)，平衡常数K称为分布系数或分配系数：0)(.PTGsssaRT lnmmmaRT lnmmssaRTaRTlnln)exp(RTCCKms18.2.3分布等温线分布等温线分布系数与溶质浓度无关或随溶质浓度变化而改变。在恒定温度下，将CS 对Cm作图所得组分或溶质在两相中的浓度关系曲线，称为分布等温线。 18.2.4 分布

7、等温线方程分布等温线方程 描述吸附等温线的数学方程称为等温线方程。由于固体对气体或溶液的吸附现象十分复杂，等温线形状多种多样，有些还无合适方程来描述，在色谱领域常用的等温线方程主要有三种。 Freundlich方程nKPmX1nKCmCs1CmnKCslg1lglg18.2.4 分布等温线方程分布等温线方程.Langmuir方程 . BET(Bnunaure-Emmett-Teller)方程PKPKKCsmX.1.121) 1(1)(.002PPCPPCPKCsmX0220) 1(1)(CPKPCCKPPCsP18.2.5色谱流动相流速色谱流动相

8、流速流动相的流速通常有两种度量方式：1. 体积流速：以Fc表示，为单位时间流过色谱柱的平均体积表示，单位一般为mLmin-1。 2. 线速度：以u表示，定义为单位时间内流动相流经色谱柱的长度，也可称为速率，单位是cmmin-1、mmmin-1或mms-1。 MtLu 18.2.6. 色谱图色谱图 色谱柱内分离的样品各组分依次进入柱后检测器产生检测信号，其响应信号大小对时间或流动相流出体积的关系曲线称为色谱图。 18.2.6. 色谱图色谱图色谱图上的信息：1. 说明样品是否是单一纯化合物。 2. 说明色谱柱效和分离情况。3. 提供各组分保留时间等色谱定性资料和数据。4. 给出各组分色谱峰高、峰面

9、积等定量依据或按不同定量方法计算出的定量数据。 术语：基线、色谱峰高、色谱峰区域宽度、标准差 、半峰高宽度、色谱峰底宽、色谱峰面积。18.2.7. 保留值保留值 保留值(retention)是样品各组分，即溶质在色谱柱或色谱体系中保留行为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大小，与两者分子结构有关。.比移值 溶质通过色谱柱的平均线速度u与流动相平均线速度ux之比，以Rf 表示。 smmxfnnnuuR18.2.7. 保留值保留值.保留体积 死时间内流经色谱柱的流动相的体积称为死体积VM，即等于色谱柱内流动相体积。 保留时间内流经色谱柱的流动相体积，称为保留体

10、积，以VR表示。调整保留时间内流经色谱柱的流动相体积，称为调整保留体积VR。VR = tR FCVR =tRFC =( tR - tM) FC = VR - VM CMMFtV18.2.7. 保留值保留值.保留因子(retention factor) 溶质分布在固定相和流动相的分子数或物质的量之比，以k(或k)表示(无因次) 。 MSMMSSmsVVKVCVCnnkMRMMRMRtttttttk,1kRf11)1 ()1 (MSMMXMRVVKtktuutt)1 (RMSMMRVVKVVkVV18.2.7. 保留值保留值.相对保留值 相对保留值用以表述两组分或组

11、分间保留差异，亦称为选择性因子(selectivity factor)，它反映不同溶质与固定相作用力的差异。 ,1,21212ttkkKK18.2.7. 保留值保留值.保留指数 基于色谱保留值与分子结构关系，Kovats E提出以正构烷烃系列H(CH2)nH作为测定相对保留值的统一标准，并定义正构烷烃的保留指数为100n，如正辛烷保留指数为800，则欲测定某化合物(x)的保留指数以适当碳数正构烷烃的保留值表示。 )()1()()(lglglglgnRnRnRXRttttnXlglg100lglglglg100100), 1(),()()1()()(nnnXnRnRnRXRRnt

12、ttnXI)lglg(100)lglglglg(100),(),()()()()(NnNnXNnNNXRnNRRRRnNI18.2.8.色谱柱结构特性参数色谱柱结构特性参数评价色谱柱的优、劣一般根据两类指标：一是色谱柱性能指标：单位柱长的理论塔板数、特定两组分或物质对的选择性因子等二是色谱柱结构特性参数：色谱柱的总孔隙度、渗透性等，这直接关系到色谱仪器操作的流动相柱前压、分析速度等。 18.2.8.色谱柱结构特性参数色谱柱结构特性参数.色谱柱总孔隙度 柱横截面上流动相所占的分数，即色谱柱内流动相体积与柱总体积之比： .渗透率与阻抗因子 udFLdtFVVVVVC

13、CCMCCMCPiT2244PdLFVtFPLuKKCCCMCTTf20420PdPLuK22202LtPdLuPdKdMPPP18.3. 溶质分布谱带展宽溶质分布谱带展宽-色谱动力学基础理论色谱动力学基础理论18.3.1. 色谱过程的理论处理类型 色谱过程的理论处理方法可根据分布等温线呈线性或非线性；色谱过程是理想或非理想状态分为不同类型。 所谓理想色谱过程指溶质在两相间物质交换在热力学上可逆，传质速率很高，平衡瞬间实现，分子扩散可以忽略;非理想色谱这些假设都不成立。 线性理想色谱；线性非理想色谱；非线性理想色谱；非线性非理想色谱.溶质在色谱柱内分布平衡和迁移过程溶质在色谱柱

14、内分布平衡和迁移过程 .色谱流出曲线方程色谱流出曲线方程 实际色谱柱N值很大，为103106，因而洗出曲线一般趋近正态分市，可近似地用正态分布函数描述溶质分布，除以流动相体积，即可导出浓度变化方程: 当V = VR = nmaxVm，洗出色谱峰，此时溶质最大浓度Cmax,其流动相体积为VR，即为溶质保留体积： RVVVNVMeNCRR/22221RVMNC/221max22maxRVVRVNeCC22maxRttRtNeCC.理论塔板的计算公式理论塔板的计算公式 令VR V= V，当洗出溶质浓度C为最大浓度Cmax一半，即Cmax / C= 2时，V用V1/2表

15、示： 2)2/1(2max2/RVVNeCC22/122/122/1254. 5254. 522ln8ttVVVVNRRR216WtNRNLH .理论塔板的计算公式理论塔板的计算公式 为了扣除死时间的影响=，引入以调整保留时间tR计算的有效理论塔板数Neff和有效理论塔板高Heff的作为柱效指标。 22/122/122/1216254. 5254. 5tttttttNRRMReffeffeffNLHeffNkkN21 effHkkH2. 塔板理论的成就和局限塔板理论的成就和局限 塔板理论中的理论塔板数和板高按在色谱柱效评价中具有重要实用价值。 然而，色谱是一个

16、动态过程，区别于萃取、精馏等分级过程，不可能实现溶质在两相间真正分布平衡；忽略扩散、传质、瞬间实现平衡的假设也不符合色谱过程分子运动规律。 塔板理论不能说明为何理论塔板数随流动相流速变化；色谱过程中溶质分子分布离散的原因；也未能深入探讨色谱柱结构、操作条件等对理论塔板数或塔板高度的影响，因而对色谱柱制备、操作条件优化等色谱实践的指导作用有限，而这正是色谱理论进一步发展的内在推动力。 18.3.3. 速率理论速率理论.塔板高度的统计意义以标准差2 作为分子在色谱柱内离散的度量，总的分子离散度应为单位柱长离散度之和，且与柱长呈正比，即2 = HL。比例因子H=2/L，等于各独立分子

17、离散因素之和：niiiiHHHHHLLLL. 速率理论方程速率理论方程 uCmCsuBACuuBAH)(/)11(/uCAuCuBHms/AuCuBHsuCAAm11.气相色谱速率理论方程气相色谱速率理论方程1.涡流扩散项(A) 流动相携带溶质分子沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些分子沿较窄而直的路径以较快的速度通过色谱柱，发生分子运动超前; 而另一些分子沿较宽或弯曲的路径以较慢的速度通过色谱柱，发生分子运动滞后，导致色谱区带展宽，可以下式表示：pdA.气相色谱速率理论方程气相色谱速率理论方程2. 纵向扩散项(B/

18、u) 亦称为分子扩散。浓差扩散是分子自发运动过程。3.传质项(Cu) 色谱分离过程溶质在流动相和固定相之间进行质量传递。uDuBm/2/sfSfSSDdkkqDdkfC222.)1 () (uDdkkuDdkkuDdHsfmPmP.)1 (.8.)1 (01. 02222222. 液相色谱速率理论方程液相色谱速率理论方程 高效液相色谱与气相色谱速率理论方程的主要区别要归因于液体与气体性质差异。 uDdkkuDdkkquDduDduCuCuCuBAHHHHHHmPiisfmPmPsmsmsmsmde.)1)(1 (30)1 (.)1 (.2222222. 影响

19、柱效的变量影响柱效的变量1.流动相流速(u) )/(smoptCCBu)(2minsmCCBAH. 影响柱效的变量影响柱效的变量2.填料粒径(dP) 涡流扩散A随dP线性下降。 3. 色谱柱温 温度影响扩散系数Ds和Dm，从而影响分子扩散和传质速率。 . 折合参数板高方程折合参数板高方程 为了在同一基础上比较不同填料粒径、不同色谱方法柱性能和解释分离条件对柱效影响，Giddings首先提出用填料粒径(dp)为单位，作为归一化度量板高(H)、流动相线速(u)、柱长(L)等无量纲折合色谱参数。 定义折合板高h=H/dp，折合流速=u dp/Dm，折合柱长l=L/dp

20、。其中折合流速是流动相流经一颗填料的线速度与扩散速率之比。 . 折合参数板高方程折合参数板高方程 利用巳建立的h -关系，可指导最佳色谱参数选择。如 = 3 能 获 得 最 小 h 值 。 由3=udp/Dm=ldp2/Dm.tM，可导出最佳填料粒径关系式:ltDdMmp/318.4. 组分分离组分分离-基本分离方程基本分离方程18.4.1. 分离度 分离度(Resolution)定义为相邻两组分色谱峰保留值tR2，tR1之差与两峰底W2，W1平均宽度之比，以R表示。 )()(2)(2/112121212WWttWWttRRRRR当R = 1，两色谱峰交叠约4%，可称为基本分离

21、。当R = 1.5，两色谱峰交叠约0.3%，可视为完全分离。 18.4.2. 分离方程分离方程当相邻峰保留值相近时，近似地W1 = W2 = W，并按分离度与理论塔板数N的平方根呈正比。分离某”物质对”达到一定分离度需要的理论塔板数和柱长为：RtNW421214421212kkkNtttNWttRRRRRR22114kkNR222221116kkRN18.4.3分离速度及影响因素分离速度及影响因素 在考虑组分分离时，另一个密切相关的因素是实现分离所需时间，既分离速度。完成分离所需时间决定于迁移速率较慢的组分，既组分2的迁移线速度u2。18.4.4. 色谱柱峰容量 一定色谱操作条件下，色谱柱在一

22、定时间能容纳达到一定分离度(R1)色谱峰的数量。 峰容量与样品容量有一定差别，后者指正常色谱条件下溶质在两相间有效分配洗出对称色谱峰容许的最大样品量。 uHkkRtR2232222) 1(11618.5 色谱方法选择和分离操作条件优化色谱方法选择和分离操作条件优化 通过色谱分离方程分析、初步实验数据估算，从易至难，采取各种技术手段，实现色谱分离操作条件优化。 18.5.1 色谱方法选择色谱方法选择 根据样品物理、化学性质和分析要求选择色谱方法。 既可用气相色谱，亦可采用高效液相色谱分析的样品，通常首选气相色谱法，因为前者分析成本相对低些。 总体来看，高效液相色谱比气相色谱适用的样品类型、范围或

23、应用领域要广得多。 18.5.2 分离操作条件优化分离操作条件优化.提高理论塔板数1. 适当增加柱长2.提高柱效 柱效通常指单位柱长的理论塔板数N。据根板高方程，H随流动相流速u变化。 此外，降低固定相填料粒径dP、固定相液膜或键合层厚度df ;采用低相对分子质量、低粘度流动相及适当提高柱温以改善传质等均有利于提高柱效。12122)/(NRRN12122)/(LRRL . 调节、控制保留因子调节、控制保留因子221kQkR22322)1 ( kkQtR.提高选择性因子提高选择性因子 R正比于(-1)/。 =1，R=0，两组分不可能分离; 略大于1

24、，两组分才可能分离; 25，分离比较容易实现。从1.01增大到5，(-1)/增加近100倍。 相比之下，k从1增大到50，k/(1+k)从0.5变化至接近于1，只增大一倍。 显然，是影响R最敏感的因素。 保持k 在110的范围内，提高值可采取下述措施： 1. 改变流动相组成 2. 改变柱温 3. 改变固定相 18.6. 色谱定性分析色谱定性分析 18.6.1保留值定性 .与已知物对照定性 色谱保留值与分子结构有关，但缺乏典型的分子结构特征，因而只能鉴定已知物。 在同样色谱条件下，用已知化合物与样品中色谱峰对照定性；或将已知化合物加入样品中导致某色谱峰增高定性，这是色谱基本定性方

25、法。.其他定性方法 按保留值经验规律定性。参考文献保留数据定性。 18.6. 色谱定性分析色谱定性分析 18.6.2选择性检测响应定性 色谱仪器一般配置通用型和选择性检测器，前者对所有化合物均有响应，后者只对某些类型化合物有响应。18.6.3 色谱-结构分析仪器联用 结构分析仪器提供分子结构信息，可对化合物直接定性。色谱-结构分析仪器联用，将结构分析仪器作为色谱检测器，色谱的高分离能力与结构分析仪器的成分鉴定能力相结合，使各种色谱联用技术成为当今最有效的复杂混合物成分分离、鉴定技术。 18.7 色谱定量分析色谱定量分析18.7.1 定量依据 根据检测响应信号大小，测定样品中各组

26、分的相对含量。 每个组分的量(质量或体积)与色谱检测器的响应值呈正比，一般与峰高或峰面积响应呈正比。 色谱峰面积(A)以峰高与半峰高宽(2X1/2)相乘求出。 一般保留值小、峰宽窄且难以准确测量的组分，可按峰高定量。多数情况下按峰面积定量为宜。 18.7.2 定量方法定量方法.标准校正法或外标法 最直接的定量方法是配制一系列组成与样品相近的标准溶液。按标准溶液色谱图，可求出每个组分浓度或量与相应峰面积或峰高校准曲线。 在实际分析中，可采用单点校正： iiissiAfAAWW18.7.2 定量方法定量方法.内标法 选择一个一般不存在于样品中的合适内标化合物。 要求

27、内标物是高纯化合物；与样品中各组分很好分离，且不与组分发生化学反应；分子结构、保留值与检测响应最好与待测组分相近。 首先需测定待测组分、内标物对某一标准物的相对定量校正因子。组分i的相对定量校正因子fi定义为组分定量校正因子与标准物定量校正因子之比。 ssiiiAWAWf/ssisisisAWAWf/isisisiiiWfAfAW%100%100%WWfAfAWWPisisisiiii%100%100%WWAfAWWPisisiiii18.7.2 定量方法定量方法.峰面积归一化法 样品中所有组分全部冼出，在检测器上产生相应的色谱峰响应，同时已知其相对定量校正因子，可用归一化法测

28、定各组分含量。 %100.%21iiiiniiifAfAWWWWWP5. 容量因子和相对保留值*容量因子（k）容量因子也叫质量分配比和容量比，是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量（m）之比流动相流速用平均线速度u（cm/min）代替体积流速F（ml/min），组分流速为v，两者之比为保留比（R） R=v/u，如果在长为L的色谱柱中， v=L/tR，u=L/to R = to/tR 保留比与溶质分子在流动相中的分数有关： 所以由上式和 R = to/tR， 得： tRto(1+k)或 该式叫色谱方程，表示保留时间与分配系数得关系，在色谱柱一定时，Vs和Vm一定。若流

29、速、温度一定，则to一定，tR取决于分配系数K，K大得组分保留时间长由tRto(1+k)式得： 分离因子即相对保留值（a） 为两组分的静保留值之比 a= k2/k1=tR2/tR1 代表了两个物质在相同色谱条件下的分离选择性，物质的化学性质和结构上的差异，在其与固定相和流动相之间的作用力差别也有体现6.分辨率（R）（分离度） 两组分色谱峰的最高点之间的距离（表示为两个保留时间之差）和两个谱带宽度（W）的算术平均值之比 由于a=tR2/tR1 则有， N-理论塔板数，H-塔板高，Neff-有效塔板数色谱中的名词 固定相，载体，分离介质，流动相，色谱图，色谱峰，基线，峰宽，峰面积，峰高，保留时间，

30、保留体积，流动相流速，信号响应，拖尾，对称峰，肩峰，重叠，柱长，塔板高度，理论塔板数，有效塔板书数，容量因子，分辨率，分离度，内标法。外标法 ，六.几种色谱法的分离机理 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱 对离子色谱 毛细管电色谱1.分配色谱 基于样品组分在固定液（涂在载体上的液相）和流动相之间的分配进行分离。类似液-萃取分离液 气-液分配色谱 ，GC 液-液分配色谱，硅胶S1100+3，3-二羟基丙晴，流动相正己烷 正相分配色谱和反相分配色谱2.吸附色谱 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别实现分离 固定相为吸附剂，多孔型微粒状物质，具有较大比表面积，表面有许多吸附中心，硅胶表面的吸附中心为硅羟基 流动相的洗脱能力主要由其极性决定，强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力也强，使组分的保留值小， 流动相的洗脱能力用Snyder提出的溶剂强度定量表示正戊烷0.00，氯仿0.26，乙醚0.43，乙睛0.52，甲醇0.70 气-固吸附色谱