第十一章动物基因工程

1、第十一章动物基因工程基因工程(gene engineering)常和以下名称混用l遗传工程(genetic engineering);l基因克隆(gene cloning);l分子克隆(molecular cloning);l基因操作(gene manipulation);l重组DNA技术(recombination DNA technique)l克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.l作动词时是指基因的分离与重组过程。第一节基因工程的发展历程第一节基因工程的发展历程l1973 Cohen第一例成功的克隆实验l1978 Genente

2、ch公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 l1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 l1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 l1993 基因工程西红柿在美国上市l1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 (第一代)Bt抗虫玉米传统玉米簡介4 (Input Traits)Source: Monsanto黃金米可以防治维生素A缺乏症成为健康食品 ( (第二代第二代) )5(Output Traits)世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物特性转基因作物特性批准项数批准项数所占比例所占比例抗除草剂抗除草剂129729.6%抗虫抗虫

3、104623.8%提高产品质量提高产品质量88620.2%抗病毒抗病毒4369.9%改善农学性状改善农学性状2114.8%抗真菌病抗真菌病2084.7%其他其他3036.9%总计总计4387100%转基因作物种植面积00.511.522.533.54千万公顷19951996199719981999年份全世界转基因作物种植面积全世界转基因作物种植面积複製人! 和我有什麼關係 陳文君著 泛亞 2001好好吃的樣子我也想吃!(第三代)6(Output Traits)l将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使

4、其价格降低了30%-50%!带有人生长激素基因的转基因小鼠正常小鼠19821982年年: : “超级鼠超级鼠”l干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。l基因工程人干扰素-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。l人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。转基因鱼转基因鱼生长快、

5、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)转基因牛转基因牛乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆不会引起过敏的转基因大豆Fourteen month-old genetically engineered (“biotech”) salmon (left) and non-engineer salmon (right). 世界上第一個.基因改造蕃茄1994年美國加州FlavrSavr Tomato, CalgenePhoto by Jack

6、Dykinga. Sources ARS Photo Unit, 2001, USDA.3Sometimes Biotechnology Involves the Manipulation of Natural Biological Processes Without Modifying GenesDolly (left) was a clone created without the need for any genetic modifications. Dolly and surrogate MomThe Biotechnology of Reproductive Cloning(Scie

7、nce (2002) 295:1443)Copy Cat the First Cloned PetSoul Mates Five Genetically Identical PigletsUSUs Contribution A Cloned Mule基因工程试剂的高回报l碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子 231元元/ugl红细胞生成素红细胞生成素 1072元元/ugl白细胞介素白细胞介素-2 410元元/ugl巨细胞粒细胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元元/ugl胰岛素胰岛素 10.2元元/mg第二节基因工程的一般原理第二节基因工程的一般原理一、常用的工具酶一、常用

8、的工具酶限制性核酸内切酶（类）切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基二、基因工程的基本程序二、基因工程的基本程序一.分载体和目的基因的分离二.切限制性内切酶的应用三.接载体与目的基因连接成重组体四.转基因序列转入细胞五.筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定l基因克隆示意图基因克隆示意图目的基因 载体DNA(限制性内切酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞一一.分分载体和目的基因的分离载体和目的基因的分离l（一）载体l1.质粒（plasmid)l2.噬菌体（phage

9、)l3.动物病毒载体（virus)质粒存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）pBR322Eco RHind Bam HAva Pvu Sal Pst O r i 氨苄青霉素 抗性基因 四环素抗性基因（二）（二）.目的基因的来源和分离目的基因的来源和分离l 1.PCRl 2.基因组文库l 3. cDNA文库l 4.人工化学合成二二.切切限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用l1.限制性内切酶概念l简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特定碱基序列，并由此切割DNA双链结构的核酸

10、内切酶。l限制酶从原核生物中提取，现已发现了600多种。 2.命名命名3.作用作用型限制性内切酶的基本特征型限制性内切酶的基本特征l在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使DNA双链断裂；l识别序列一般为47个碱基对，这些碱基顺序大都是沿中心轴回转180可以重合，也称回文序列。l能产生两种切割方式：l错位切割产生具有5-或3-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端 三三.接接载体与目的基因连接成重载体与目的基因连接成重组体组体l 1.粘性末端连接l 2.平端连接常用的DNA限制性内切酶的专一性酶酶辨认的序列和切口辨认的序列和切口说明说明 A G C T T C

11、G A G G A T C C C C T A G G A G A T C T T C T A G A G A A T T C C T T A A G A A G C T T T T C G A A G T C G A C C A G C T G C C C G G G G G G C C C Bam H IAlu IBgl IEco R IHind Sal ISma I四核苷酸，平端切口四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，

12、粘端切口六核苷酸，粘端切口四四.转转基因序列转入细胞基因序列转入细胞l1.转化l以质粒作为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程l2.转染l以噬菌体或或病毒为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程五五.筛筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定目的基因序列克隆的筛选和鉴定l1.按重组载体的标志进行筛选l2.核酸杂交法l3. DNA限制性内切酶图谱分析l4.PCRl5.免疫学方法1. 据重组载体的表型进行筛选据重组载体的表型进行筛选l可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。l如质粒pBR332，由4362个核苷酸对构成对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。2. DNA 限制酶切图谱分析限制酶切图谱分析

13、l提取重组DNAl经限制性内切酶切割l在琼脂糖凝胶电泳l比较重组体与原来载体从DNA片段的大小与有无来区别是否已发生重组。3. 利用核酸杂交和放射自显影进利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定行鉴定l将菌落DNA转移到硝酸纤维素滤膜上，l另外用放射同位素，标记目的基因，制成溶液，作为“探针”l将菌落DNA与“探针”一起温育，若菌落含有目的基因，就可把“探针”吸附住l把已和探针溶液作用过的滤膜冲洗、烘干，与线底片夹在一起放阴暗处数天，经显影后，有目的基因的所在位置会出现黑点，从黑点位置与菌落DNA比较及鉴定之。克隆基因的表达克隆基因的表达l 1.大肠杆菌表达系统l 2.真核细胞表达系统第三节第三节 转

14、基因动物技术转基因动物技术 一、转基因动物的概念 l转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。l它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。l1981年Gordon和Ruddle首次用显微注射法(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生了的78只小鼠，其中有2只的所有细胞中(包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠(Transgenic Mice)，自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物(Transgenic animal)。二、转基因动物技术的一般步骤二、转基因动物技

15、术的一般步骤 (1)选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发(7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。 三、导入基因的方法三、导入基因的方法 导入外源基因的方法有多种，一些方法已在上一节作过叙述，如：反转录病毒转染法；磷酸钙沉淀法；脂质体介导法；血影细胞(Blood shadow cell)介导法。在此再介绍一些方法，1）DNA微注射法；2）精子载体法；3)胚胎干细胞（ES）介导法；4) 染色体片段注入法；5) 电转移法等。在转基因动物中，DNA微注射法比较常用。 四、基因的选择与转基因动物的四、基因的选择与转基因动物的研究现状研究现状 (一) 转入基因的选择 (二) 转基因动物的研