南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶

1、8080年代以来，生物工程研究和开发的新领域。年代以来，生物工程研究和开发的新领域。动物细胞通过离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化动物细胞通过离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化等获得；等获得；培养方式有悬浮培养、贴壁培养、微载体培养；培养方式有悬浮培养、贴壁培养、微载体培养；获得疫苗、激素、多肽、单抗等；获得疫苗、激素、多肽、单抗等；植物细胞通过捣碎、酶解、愈伤组织诱导获得；植物细胞通过捣碎、酶解、愈伤组织诱导获得；培养方式有固体培养、液体层培养、悬浮培养等；培养方式有固体培养、液体层培养、悬浮培养等；主产色素、药物、香精、酶等。主产色素、药物、香精、酶等。l动物细胞动物细胞无细胞壁无

2、细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，对营养要求严格，除氨除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括清。动物细胞对环境敏感，包括pHpH、溶氧、温度、剪、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。和控制。l植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养胞培养

3、一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的，长时间的培养培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。动植物、微生物细胞的培养比较动植物、微生物细胞的培养比较微生物微生物动物细胞动物细胞植物细胞植物细胞 大大 小小悬浮生长悬浮生长营养要求营养要求生长速率生长速率代谢调节代谢调节环境敏感环境敏感细胞分化细胞分化剪切应力敏感剪切应力敏感传统变异，筛选传统变异，筛选技术技术细胞或产物浓度细胞或产物浓度1-101-10可以可以简单简单快，倍增时快，倍增时间间0.5-50.5-5小时

4、小时内部内部不敏感不敏感无无低低广泛使用广泛使用较高较高10-10010-100多数细胞需附着多数细胞需附着表面才能生长表面才能生长非常复杂非常复杂慢，倍增时间慢，倍增时间15-10015-100小时小时内部、激素内部、激素非常敏感非常敏感有有非常高非常高不常使用不常使用低低10-10010-100可以，但易结团，可以，但易结团，无单个细胞无单个细胞较复杂较复杂慢，倍增时间慢，倍增时间24-7424-74小时小时内部、激素内部、激素能忍受广泛范围能忍受广泛范围有有高高有时使用有时使用低低从中得到最普遍而必不可少的药物有从中得到最普遍而必不可少的药物有1717类；类；全世界用其制备天然芳香化合物

5、的价值超过全世界用其制备天然芳香化合物的价值超过1515亿亿/ /年；年；美国用其生产药物超过美国用其生产药物超过3030亿亿/ /年；年；我国使用的中草药及其制备大部分来自植物。我国使用的中草药及其制备大部分来自植物。植物来源的物质生产几乎采用提取分离法，植物来源的物质生产几乎采用提取分离法，如从木瓜中提取木瓜蛋白酶；如从木瓜中提取木瓜蛋白酶；19021902，HaberlandtHaberlandt提出分离植物单细胞培养提出分离植物单细胞培养成株的设想，至今已成为专门学科。成株的设想，至今已成为专门学科。通过植物细胞产酶的进展：表通过植物细胞产酶的进展：表3-13-1目前植物细胞发酵产酶概

6、况目前植物细胞发酵产酶概况: 酶酶 植物细胞植物细胞 （年份）（年份） 糖苷酶糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 漆酶漆酶 过氧化物酶过氧化物酶 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 酸性转化酶酸性转化酶 碱性转化酶碱性转化酶 糖化酶糖化酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶苯丙氨酸氨裂合酶 胡萝卜细胞胡萝卜细胞 （1981） 紫苜宿细胞紫苜宿细胞 （1982） 假挪威槭细胞假挪威槭细胞 （1983） 甜菜细胞甜菜细胞 （1983） 大豆细胞大豆细胞 （1989） 利马豆细胞利马豆细胞 （1987） 甜菜细胞甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞甜菜细胞 （1988） 木瓜细胞木瓜

7、细胞 （1990） 花生细胞花生细胞 （1986） 大豆细胞大豆细胞 （1989）表表3-1 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶和動物細胞相似細胞壁(Cell Wall)細胞膜 (Cell membrane)細胞质(Cytoplasm)液泡(Vacuole)細胞核(Nucleus)叶綠体(Chloroplast)固体顆粒(Solid granule)线粒体(Mitochondrion)覆盖在細胞膜外，由纤维素构成，虽然厚但可让物质自由穿过。功能：1.支持細胞，使它有固定形状。2.保护細胞 植物細胞通常有较大的液泡 许多植物細胞都含有叶綠綠体体；內有綠色的叶綠素綠素，钠负吸收光能，进行光合行用 如

8、淀粉颗粒和不溶解的废物 植物細胞的植物細胞的构构造造 表表2-2 微生物、植物、动物细胞的特性比较微生物、植物、动物细胞的特性比较 （P78） 微生物细胞微生物细胞 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 细胞大小（细胞大小（mm） 110 110 20300 20300 10100 10100 倍增时间（倍增时间（h h） 0.36 0.36 12 12 15 15 营养要求营养要求 简单简单 简单简单 复杂复杂 对剪切力对剪切力 大多数不敏感大多数不敏感 敏感敏感 敏感敏感 主要产物主要产物醇类，有机酸，醇类，有机酸，氨基酸，抗生素，氨基酸，抗生素，酶，核苷酸酶，核苷酸色素，香精，色素，香精，

9、药物，酶药物，酶激素，疫苗，激素，疫苗，单克隆抗体，单克隆抗体，酶酶例如例如, ,紫草宁紫草宁( (shikonin)shikonin)生产，发酵细胞中的紫生产，发酵细胞中的紫草宁比草宁比 紫菜根紫菜根( (Lithospermum Lithospermum erythrorhizon)erythrorhizon)中高中高1010倍，比产率达到种植紫倍，比产率达到种植紫草的草的830830倍。倍。紫草宁及其结构紫草宁及其结构（1 1）提高产率）提高产率（2 2）缩短周期）缩短周期发酵周期发酵周期10103030天，种植周期几个月几年。天，种植周期几个月几年。（3 3）易于管理）易于管理减低劳动

10、强度；不受地理环境和气候条件等影响。减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4 4）提高产品质量）提高产品质量主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有害物质污染和侵蚀。害物质污染和侵蚀。（5 5）其它）其它生物反应器的设计工艺条件注意的问题。生物反应器的设计工艺条件注意的问题。三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（一）植物细胞培养的工艺流程（一）植物细胞培养的工艺流程外植体外植体细胞细胞获取获取细胞细胞培养培养分离分离纯化纯化产物产物gol从植株取出，预处理后用于植物组织从植株取出，预处理后用于植物组织

11、细胞培养的片段或小块；细胞培养的片段或小块；l选择无病虫害，生长旺盛的植株；选择无病虫害，生长旺盛的植株；l切成小块，消毒，漂洗切成小块，消毒，漂洗backl（）直接分离法，有机械法、酶解法；（）直接分离法，有机械法、酶解法；l（）愈伤组织诱导法；（）愈伤组织诱导法；l（）原生质体再生法（）原生质体再生法需要大量无机盐，除需要大量无机盐，除P P、S S、K K、CaCa、MgMg外，外，还需还需B B、MnMn、ZnZn、MoMo、CuCu、CoCo、I I需要各种维生素和植物激素，如硫胺素、吡哆需要各种维生素和植物激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、激动素等。素、烟酸、肌醇、激动素等。Si

12、x major groups of plant hormones :1, AUXINS 茁长素;2, CYTOKININS细胞分裂素;3, GIBBERELLINS 赤霉素;4, ABSCISIC ACID 脱落酸;5, ETHYLENE 乙烯;6, BRASSINOSTEROIDS 苔云素一般为无机氮源。一般为无机氮源。一般以蔗糖为碳源。一般以蔗糖为碳源。（二）植物细胞培养的培养基（二）植物细胞培养的培养基（三）温度的控制（三）温度的控制室温（室温（2525）、）、（四）pHpH值的控制值的控制 微酸性（微酸性（pH5pH56 6）（五）溶解氧的调节控制五）溶解氧的调节控制代谢慢，耗氧少，对

13、剪切力敏感，搅拌不宜强烈。代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。（六）光照的控制（六）光照的控制（七）前体的添加（七）前体的添加提高次级代谢物的产量。提高次级代谢物的产量。（八）刺激剂（八）刺激剂(electior)(electior)的应用的应用强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞壁碎片和胞外酶。壁碎片和胞外酶。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)是生物体内是生物体内清除超氧化物阴离子自由基清除超氧化物阴离子自由基(O (O 2)2)的重要金属酶类。它和过氧的重要金属酶类。它和过氧化氢酶、过氧化物酶一起构成了化氢酶、过氧化物酶

14、一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应。衰老自的生理代谢和生化反应。衰老自由基学说认为衰老源于机体正常由基学说认为衰老源于机体正常代谢过程中产生过量的自由基对代谢过程中产生过量的自由基对机体损害的结果。超氧化物歧化机体损害的结果。超氧化物歧化酶酶(SOD)(SOD)作为能催化超氧阴离子发作为能催化超氧阴离子发生歧化反应的自由基清除剂，具生歧化反应的自由基清除剂，具有延缓衰老的作用。有延缓衰老的作用。天瑞天瑞SOD苹果苹果 l、大蒜愈伤组织的诱导、大蒜愈伤组织的诱导l、大蒜细胞的悬浮培养、大蒜

15、细胞的悬浮培养l、的分离纯化、的分离纯化18851885年年RouxRoux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语组织培养这个术语; ;19071907年年HarrisonHarrison 和和19121912年年CarrelCarrel开始把组织培养开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养; ;由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一

16、门精细技术。许多细胞株、产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如的各种细胞系，如HelaHela细胞系（细胞系（GeyGey，19521952），可用来），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展; ;2020世纪世纪5050年代年代,Earle,Earle,病毒疫苗细胞培养病毒疫苗细胞培养; ;1967,1967,动物细胞贴壁培养微载技术动物细胞贴壁培养微载技术; ;1975,1975,杂交瘤技术杂交瘤技术; ;动物细

17、胞可产生较高价值的物质动物细胞可产生较高价值的物质, ,特别是激素、疫苗，特别是激素、疫苗，单克隆抗体和酶等动物功能蛋白。单克隆抗体和酶等动物功能蛋白。动动物細胞的物細胞的构构造造細胞膜(Cell membrane)細胞质(Cytoplasm)細胞核(Nucleus)液泡(Vacuole)固体颗粒(Solid granules)线粒体(Mitochondrion)一层薄膜，由脂类和蛋白质构成；功能：1.包裏細胞质 2.控制物质进入細胞 呈胶狀的混合物，含多种化学物如：蛋白质和水；包围着更小的細胞器如线粒体和液泡；是細胞內所进行化学反应的媒介。 內含染色体。染色体携帶遗传讯息及控制細胞里所有活动

18、。 被一层薄膜包围，內含溶解的化学物质和食物粒子等。 在呼吸作用中协助释放能量。 l1,1,无细胞壁无细胞壁, ,脆弱脆弱; ;l2,2,体积比微生物细胞大几千倍体积比微生物细胞大几千倍, ,稍小于植稍小于植物细胞物细胞; ;l3,3,具有群体效应、锚定依赖性、接触抑具有群体效应、锚定依赖性、接触抑制性、功能全能性；制性、功能全能性；l4 4，营养要求复杂。，营养要求复杂。l1 1，主产各种功能蛋白；，主产各种功能蛋白；l2 2，生长缓慢；，生长缓慢；l3 3，需加抗生素防污染；，需加抗生素防污染；l4 4，对剪切力敏感；，对剪切力敏感；l5 5，具锚定依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮，具锚定依

19、赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养；培养；l6 6，培养基成分复杂；，培养基成分复杂；l7 7，原代细胞培养，原代细胞培养5050代后需重新分离细胞。代后需重新分离细胞。来自血液、淋巴组织来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞、的细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞等非锚定杂交瘤细胞等非锚定依赖性细胞采用。依赖性细胞采用。类似于微生物细胞的类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条深层发酵，但工艺条件有较大差别。件有较大差别。杂交瘤细胞半悬浮培养杂交瘤细胞半悬浮培养 1、悬浮培养、悬浮培养l可连续收集部分细胞进行移植继代培养，可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、传代时无需消化分散，免遭

20、酶类、EDTAEDTA及机械损害。及机械损害。l细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。还有可能实现大规模直接克隆培养。 l培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含一定速度通入含5 5COCO2 2的无菌空气，保持细胞悬浮的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。态并维持培养液溶解氧。l此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在

21、配制培养基的基础盐溶液中不加成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持持pHpH值，若使用值，若使用HEPESHEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含通入含5 5COCO2 2空气。空气。 来自动物器官中的细胞，采用来自动物器官中的细胞，采用: :（1 1）滚瓶培养系统）滚瓶培养系统: :结构简单结构简单, ,重现性好重现性好; ;将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养悬浮培养，使细胞在微载体表面长

22、成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法。方法称为微载体培养法或微珠培养法。由葡聚糖凝胶制成微球由葡聚糖凝胶制成微球, ,动物细胞依附其上单层动物细胞依附其上单层生长繁殖生长繁殖, ,悬浮于培养液中悬浮于培养液中; ;特点特点: :比表面积大比表面积大, ,单位体积培养液细胞产率高单位体积培养液细胞产率高; ;具有悬浮培养的优点具有悬浮培养的优点. .l制备微载体的材料主要有：制备微载体的材料主要有：葡聚糖（葡聚糖（DEAESephadex ADEAESephadex A5050及及A A25 25 ） 塑料塑料明胶明胶玻璃玻璃纤维素纤维素 l兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是兼具单层培养

23、和悬浮培养的优势，且是均相培养。均相培养。l细胞所处环境均一，放大容易。细胞所处环境均一，放大容易。l培养操作可系统化、自动化，障低了污培养操作可系统化、自动化，障低了污染发生的机会。染发生的机会。动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术谓之细胞固定化培养法。谓之细胞固定化培养法。锚定与非锚定依赖性动物细胞均可锚定与非锚定依赖性动物细胞均可; ;一般采取：一般采取：吸附法吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 ）；包埋法包埋法（将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中）l细胞可维持在较小体积培养液中生长；细胞可维持在较小体积培养液中

24、生长； l细胞损伤程度低；细胞损伤程度低； l易于更换培养液；易于更换培养液； l细胞和培养液易于分离；细胞和培养液易于分离； l培养液中产物浓度高，简化了产品分离培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。纯化操作。 l一般细胞培养液的一般细胞培养液的pHpH在在7.0-7.47.0-7.4之间。由于碳酸盐之间。由于碳酸盐pHpH缓冲系统是一种生理缓冲系统是一种生理pHpH缓冲系统（它是人体血液中缓冲系统（它是人体血液中最重要的最重要的pHpH缓冲系统），大多数培养液用它来保持稳缓冲系统），大多数培养液用它来保持稳定的定的pHpH。用粉末配制培养液时，常常需要加入一定量。用粉末配制培养液时，

25、常常需要加入一定量的碳酸氢钠。的碳酸氢钠。l对大多数以碳酸盐作为对大多数以碳酸盐作为pHpH缓冲系统的培养液而言，缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的以为了维持稳定的pHpH，培养箱中的二氧化碳需要维持，培养箱中的二氧化碳需要维持在在2-10%2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。体的交换。l体外培养的细胞大多具有生长接触抑制体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时

26、候，它就会停止生长。当细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。细胞就会逐步取代正常的细胞。l种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞；种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞；l工艺过程：工艺过程：种质种质细胞细胞胰蛋白酶胰蛋白酶悬浮悬浮细胞细胞悬浮培悬浮培养或贴养或贴壁培养壁培养收集培收集培养液分养液分离纯化离纯化l1 1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等，、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用；作为碳源和能源利用；l2 2、维生素：血清中，、维生素：血清中，B B族和维族和维C C；l3 3、无机盐：调节渗透压；、无机盐：调节渗透压；l4 4、葡萄糖：作为碳源和能源；、葡萄糖：作为碳源和能源；l5 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化