微生物菌种鉴定及保藏

1、1微生物菌种鉴定与保藏微生物菌种鉴定与保藏柳志强柳志强浙江工业大学生物工程研究所浙江工业大学生物工程研究所134861184632内容1.菌种筛选2.菌种鉴定3.菌种保藏3微生物代谢产物的平板检测方法有机酸有机酸: 柠檬酸:pH指示剂的颜色变化,或掺入琼脂平板的碳酸钙的溶解.胞外酶胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄榄油琼脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果胶酶:果胶凝胶的液化(1.5%的聚果胶酸钠),多糖沉淀剂5.弹性蛋白酶:弹性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸过量时可见

2、混浊.或者氮蒽橙荧光和紫外荧光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混浊圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纤维素酶:纤维素平板的透明圈10.酯酶:氯化钙和Tween20释放出的月桂酸反应生成月桂酸钙沉淀.或者7-羟-4甲基香豆素荧光反应. DNA酶:亚甲胺蓝的DNA荧光变化 过氧化酶:喷洒对-茴香碱-过氧化氢酶抑制剂酶抑制剂:(用含酶的琼脂平板上的抑制圈筛选)1.胰蛋白酶抑制剂:2.蛋白酶抑制剂 其他的代谢物其他的代谢物:1.脂类. 酵母的脂类营养缺陷型的生长谱来捡出2 . N A D : 以 猪 流 感 嗜 血 菌 （haemophilus inflluenzae ）的生长谱来捡出3.雌激素:喷

3、洒对硝基苯重氮盐 （1%在50%乙酸中）形成红色捡出4.chlorostatin: Euglena gracilis 褪绿圈 4567影印法8显微镜 第一代 第二代 第三代9细菌的形态和结构观察在显微镜下观察细菌个体的形态细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。10 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。11 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。12 放线菌菌落在

4、培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。 放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为在培养基内部的基内菌基内菌丝丝和伸出培养基表面的气生菌丝气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状或分枝状。菌丝呈各种颜色，有的能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子形状各异。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉状。链霉菌13 霉菌是由交织在一起的菌丝体构成。菌丝呈管状，有的有横隔将菌丝分割为多细胞（如青霉、曲霉），有的菌丝没有横隔（如毛霉、根霉）。菌丝直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到几十倍。菌落形态较大，质地疏松，颜色各异，有丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体。 将菌丝体放在水中易变形

5、，将其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌丝体原形。14几类酵母的菌落形态1.酿酒酵母2.产肮假丝酵母3.出芽短梗霉4.多孢丝抱酵母5.荚复膜孢酵母6.解脂复膜孢酵母7.季也蒙有孢汉逊酵母8.碎囊汉逊酵母9.卡氏酵母10.鲁氏酵母11.深红酵母12.玫红法佛酵母13.大型罗伦隐球酵母14.美极梅奇酵母15.浅红酵母1516一些鉴别培养基17 来源于不同微生物的抗生素放线菌产生放线菌产生 链霉素、红霉素、四环素、利福霉素链霉素、红霉素、四环素、利福霉素 庆大霉素、麦迪霉素、林可霉素等庆大霉素、麦迪霉素、林可霉素等真菌产生真菌产生 青霉素、头孢菌素青霉素、头孢菌素C C等等细菌产生细菌产生 多粘菌素、杆菌

6、肽等多粘菌素、杆菌肽等 目前已筛选出抗生素达目前已筛选出抗生素达90009000种以上，每年还种以上，每年还新增百余种。投入生产的仅百余种。新增百余种。投入生产的仅百余种。菌种菌种发酵工业的核心发酵工业的核心18Current Methods of Identification19BIOLOG自动微生物鉴定系统20检测原理 BIOLOG以检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质（如TTC、TV）发生颜色反应和浊度差异为基础，运用独有的显型排列技术检测出每种微生物的特征指纹图谱，在大量试验和数学模型基础上，建立起指纹图谱与微生物种类相对应的数据库。检测时通过智能软件将待鉴

7、定微生物的图谱与数据库参比，即可得出鉴定结果。21鉴定步骤分离纯化分离纯化平板扩大培养平板扩大培养制备菌悬液制备菌悬液调整浊度调整浊度接种培养接种培养获取结果获取结果22The Bacterial Identification ProcessStep 1Step 2Step 3Step 4Step 5Isolate a pure culture on Biolog mediaDo a Gram stain and determine testingprotocolPrepare inoculum at specified cell densityInoculate and incubate M

8、icroPlateRead MicroPlate and determine ID23The Fungi Identification ProcessStep 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Isolate a pure culture on Biolog media Harvest spores from the Fungi Prepare inoculum at specified cell density Inoculate and incubate MicroPlate Read MicroPlate every 24 hours and determine

9、 Identification 24Pure Cultures are ImportantKrieg, Bergeys Manual, 198625用木制接种棒挑用木制接种棒挑取分离良好的单取分离良好的单菌落菌落 26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培养基培养基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鉴定板鉴定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接种液接种液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品其它通用消耗品疏

10、基乙酸钠，水杨酸钠，试管架，吸嘴，加样槽，一次性疏基乙酸钠，水杨酸钠，试管架，吸嘴，加样槽，一次性移液管，长棉签，木制接种棒。移液管，长棉签，木制接种棒。27微生物鉴定（95种碳源）微生物研究GN2鉴定革兰氏阴性好氧菌GP2鉴定革兰氏阳性好氧菌AN 鉴定厌氧菌YT 鉴定酵母菌FF 鉴定丝状真菌SFN2用于革兰氏阴性放线菌和真菌代谢研究SFP2用于革兰氏阳性放线菌和真菌代谢研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代谢研究（不含碳源）ES 用于埃希氏大肠杆菌沙门氏菌的研究 （95种碳源）鉴定板种类282930Electron micrograph of strain ZJB-

11、05174 cells 31分子遗传学鉴定分子遗传学鉴定 32Genomic DNA extraction 33Primers design 16S/18S rDNA sequence amplification34Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)35DNA sequencing machines use fluorescent dideoxynucleotides363738394041 1001009093505924440.01 Bacillus aquimaris AY505499 Bacillus methanolicus

12、AB112729 Bacillus firmus EF032672 Bacillus oleronius AY988598 Bacillus subtilis ZJB-063 DQ474759 Bacillus subtilis AB232386 Bacillus atrophaeus isolate SCH0408 AY881241 Bacillus carboniphilus AB021182 Bacillus pseudomycoides AF013121 Bacillus indicus AJ583158 Sporolactobacillus inulinus SPO16SRR23 4

13、2 10a 1001001001007610010096100100687210056100721000.05 Cryptococcus adeliensis strain LEVX01 (DQ269445) Cryptococcus adeliensis strain RKI 456/93 (AY733078) Cryptococcus albidus var. ovalis strain CBS5810 (AF145329) Cryptococcus antarcticus strain CBS7687 (AF145326) Cryptococcus magnus (AY188384) C

14、ryptococcus vishniacii (AB032689) Rhodotorula mucilaginosa (DQ402533) Rhodosporidium kratochvilovae (DQ402534) Rhodotorula glutinis (AM160642) Itersonilia perplexans isolate AFTOL-ID 1896 (DQ667163) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24261 (DQ661025) Xanthophyllomyces dendrorhous strain KBP 2

15、604 (DQ661026) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24229 (DQ661023) Phaffia rhodozyma strain ZJB 00010 (DQ999084) Phaffia rhodozyma strain CBS 5905 (AF139629) Tricholoma aurantium isolate OUC99349 (DQ367919) Tricholoma saponaceum var. saponaceum isolate OUC99343 (DQ370440) Cyphellostereum laev

16、e isolate AFTOL-ID 982 (DQ486699) Phellinus linteus strain SFC 20001106-7 (AF534070) Phellinus baumii strain SFC 960405-4 (AF534068) 43微生物菌种保藏及其专利申请 按照1977年4月28日各国于布达佩斯签订于1980年9月26日修正的国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的解释， “微生物菌种保藏”的概念是：“向接收与受理微生物的国际保存单位送交微生物或由国际保存单位贮存此种微生物，或兼有上述送交与贮存两种行为”。 如果发明涉及新的微生物、微生物学方法或者

17、其产品，而且使用的微生物是公众不能得到的，在申请专利前或最迟在申请日，必须按各国的专利法的有关规定对微生物进行保藏，申请专利时还需提供相应的申请文件。 44国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 1.缔约国允许或要求保存用于专利程序的微生物的, 应承认为此种目的而在任一国际保存单位所做的微生物保存。这种承认应包括承认由该国际保藏单位说明的保存事实和交存日期，以及承认作为样品提供的是所保藏的微生物样品。 2.任一缔约国均可索取由国际保藏单位发出的 (1) 项所述保藏的藏单副本。 45我国专利法还应办理下列手续1.在申请日前或者最迟在申请日，将该微生物菌种提交专利局指定的微生物菌种保藏单位保

18、藏，并在申请时或者最迟自申请日起三个月内提交保藏单位出具的保藏证明和存活证明；期满未提交证明的，该菌种被视为未提交保藏；2.在申请文件中，提供有关微生物特征的资料；3.涉及微生物菌种保藏的专利申请应当在请求书各说明书中写明该微生物的分类命名（注明拉丁文名称）、保藏该微生物菌种的单位名称、地址、保藏日期和保藏编号；申请时未写明的，应当自申请日起三个月内补正；期满未补正的，该菌种被视为未提交保藏。 4647对基因的占有方式是“基因专利” 基因专利保证了专利拥有者对基因应用领域的高度垄断，其潜在经济价值和高额回报使得各国的研究机构和大小公司纷纷投入巨额资金。难以想象，如果没有专利的保护，制药公司还会

19、不会对基因开发下这么大的赌注，还会不会有基因相关产品走向市场。正是因为基因专利所赋予的高度垄断，生物技术领域每一项重要产品的问世几乎都会引来激烈的专利之争。 48基因专利的商业价值 基因专利是研制开发相关产品的基础，基因专利的权利人不仅可以通过专利合作或转让获得收益，而且还可以从基于该基因专利的基因产物以及其他衍生产品后期销售收入中按一定比例提成。一个具有重要功能的疾病或产物相关基因的专利，转让价值一般以千万美元计，而以此开发的基因药物年销售额可高达几亿至几十亿美元。 49基因药靶的价值 1998年9月，Millennium公司与Bayer公司签订了五年的基因药物合作协议，Bayer公司将向M

20、illennium支付总计4.65亿美元(包括14%的股权投资)费用，委托Millennium公司开发225种基因药靶，平均每个基因药靶的价值为207万美元。 促红细胞生成素EPO：美国Amgen公司依赖EPO基因专利的开发应用，从一个濒临破产的企业成为美国生物工程医药领域的领头羊，其EPO1998年的销售收入达到13.6亿美元，而EPO的全球市场现已达到34亿美元的销售额。 50基因专利的法律效力 基因专利受法律的保护，专利侵权将要受到法律的制裁。而且，专利授予与否的问题也要服从于法律。 HIV受体专利基因专利的垄断性曾引起轰动，2000年2月16日美国主要从事人类基因测序和商业化开发的人类

21、基因组科技股份有限公司(HGS)宣布：她向美国专利和商标局(PTO)成功申请了一个在HIV(艾滋病病毒)感染中起关键作用的基因的专利，该基因编码一个称作CCR5的细胞表面受体蛋白，该蛋白是HIV病毒侵入人体细胞所必需结合的位点。HGS指出：“该专利覆盖了艾滋病治疗的关键点” ，HGS已授权其制药业的合作伙伴开发艾滋病治疗类药物，HGS本身也试着进行一些对付HIV感染的有关抗体的研究。HGS预计：“以CCR5为药靶开发的新药，包括艾滋病治疗类药物以及抗溃疡和抗过敏类药物，每年的销售额能达到400亿美元。”消息公布后，HGS股价当天创出新高，达到188美元/股，一天内涨幅高达21%。 51HGS仅

22、仅因为对CCR5基因测了序，就获得了基于CCR5的有关专利权，而1996年那些首先发现“HIV通过与CCR5受体结合而侵染人体免疫细胞”的科学家以及那些在爱滋病研究领域做出了巨大贡献的科学家，却因在专利申请上比HGS晚了一步而无法享用基于CCR5基因的有关专利。科学家们认为“专利局把CCR5基因的潜在商业价值优先给予了一个只是做些基因测序等辅助工作的公司，而不授予为识别该受体、研究其功能做了大量科研工作的科学家，实在不太公平。”专利局的态度是，他们仍然可以受理其它的专利。但专利之间的相互交叉和覆盖势必会产生碰撞，难免带来严重的法律问题。 然而，HGS并不认为她仅仅是通过基因测序而获得了CCR5

23、的优先权，她是以测序结果为切入点，通过基因数据库的计算机分析推测基因的功能，然后再通过生物学试验进行基因功能的研究和相关药物的开发的。不过，HGS承认她在提交CCR5专利申请的时候并不知道CCR5与艾滋病之间的关系。HGS认为发现CCR5生物学功能的科学家们应该得到认可，HGS将在科研方面与科学家们共享CCR5的有关数据和试剂，但在相关药物开发方面，HGS是要严格执行其专利权利的。 由此可见，谁拥有了基因专利，谁就拥有了该基因所有用途的独占性开发权，实现的将是对整个产业的垄断。 52生物技术专利战略 当今全球性经济竞争是一种以科技竞争为中心的角逐，而最先进的科技发明信息有 90被收集在专利文献

24、中，专利保护对鼓励工业领域的创造和促进产品的开发和销售起着重要作用。因为创造性受到专利法的保护，所以，企业就愿意投资研究新技术，开发新产品。 近年来，各国科学家们也深切地体会到，传统的科学宗旨已让位于自我利益，拥有专利和对专利的追求将激发新的发明创造，从发明创造中获得公共的关注和经济资助变成了科学研究的原动力。西方大公司是世界上发明专利的主要申请者和利用者，其专利战略就是如何有目的、有效地利用这一制度。 5354定义定义 菌种保藏菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、

25、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。不污染以便于研究、交换和使用的目的。 第二节第二节 工业微生物菌种的保藏工业微生物菌种的保藏55 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低生长代谢活动尽量降低，以减少其变异减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠休眠”状态，抑制其繁殖能力状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。 菌种保藏的原菌种保藏的原理理56 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：

26、菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。57B 沙土管保藏法沙土管保藏法 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢产孢子或芽孢的微生物。制备方法制备方法：首先，将沙与土洗净烘干过筛洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为按沙与土的比例为l 2 l混合均匀混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米厘米左右左右，121C间歇灭菌三次间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用沙用80目过筛目过筛，土用土用30100目过筛目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为保存期为1年左右年左右。 58C、石蜡油封存法、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存酵母等微生物的保存。 保存期约一年左右。保存期约一年左右。59D、真空冷冻干燥保减法、真空