细胞培养基本知识

1、研究生实验技能培训讲座研究生实验技能培训讲座 细胞培养基本知识细胞培养基本知识 实验教学中心实验教学中心侯孟君侯孟君基本概念基本概念w细胞培养技术细胞培养技术 w细胞系细胞系w细胞株细胞株w原代培养原代培养w传代传代 细胞培养细胞培养(cell culture)技术技术 即是选用各种细胞的即是选用各种细胞的最佳生存条件最佳生存条件对对活细胞进行培养和研究的技术，是广活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。泛应用于医学研究领域的重要技术。细胞系细胞系w培养物开始培养物开始第一次第一次传代培养后的细胞传代培养后的细胞w有限细胞系（有限细胞系（Finite Cell Line

2、）w连续细胞系或无限细胞系（连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）w肿瘤细胞系或株肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。具有不死性和异体接种致瘤性。 细胞株细胞株w用用单细胞单细胞分离培养增殖形成的具特定分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群生长特性的细胞群w再由原细胞株进一步分离培养出与原再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。株。细胞系或细胞株的命名细胞系或细

3、胞株的命名 以供体患者的姓名命名：以供体患者的姓名命名： HeLa （来源于宫颈癌）（来源于宫颈癌）以时间地点来命名：以时间地点来命名： CHO 中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary， ）宫宫-743： 宫颈癌上皮细胞，宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立）建立 每每3天传代，每次接种天传代，每次接种3105细胞细胞ml以组织来源命名：以组织来源命名：如如BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名：以临床疾病类型命名：

4、如如BALL-1细胞系细胞系(来自来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性白血病人白细胞)原代培养原代培养w直接从体内取出的细胞进行的第一次培直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。养物。w优点：优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。的状态。 大鼠肝细胞原代培养大鼠肝细胞原代培养1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养；培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮

5、，贴壁壁 后呈不规则。后呈不规则。 传代传代w将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养w原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足空间不足或或细胞密度过大细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 HepG2细胞细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞；细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养培养的天数：传代培养2天；天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则细胞状态与特

6、征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。贴壁生长，成团聚集。 传代注意事项传代注意事项w接种数量为接种数量为51048105个个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有增长前有较长的滞留期较长的滞留期。w培养液由于培养液由于pH下降而呈现下降而呈现黄色黄色，表明细胞已经达到，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。最大密度需要换液或进行传代培养。w如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。进行传代。 细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件w无菌条件无菌条件w细胞生

7、长条件细胞生长条件w细胞检测条件细胞检测条件w细胞保存条件细胞保存条件w实验室安全实验室安全细胞培养的无菌环境细胞培养的无菌环境 w无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。作间三部分组成。 w（使用前）紫外照射（使用前）紫外照射（1小时）小时）w每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒行消毒 生物安全柜生物安全柜 w使用前开启柜内紫外灯照射使用前开启柜内紫外灯照射1030分钟，分钟，w预工作预工作1015分钟，以除去臭氧分钟

8、，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。和使用工作台面空间呈净化状态。w使用完毕后，要用使用完毕后，要用70%酒精将台酒精将台面和台内四周擦拭干净。面和台内四周擦拭干净。w还要定期用福尔马林熏蒸。还要定期用福尔马林熏蒸。 常用培养器皿及清洗消毒常用培养器皿及清洗消毒 w玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 w新的橡胶制品洗涤方法新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸煮沸15分钟，流水冲洗，分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸次，蒸馏水煮沸2

9、0分钟，分钟，50烤干备用。烤干备用。 消毒前包装消毒前包装w常用的包装材料常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔火焰消毒火焰消毒w在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。在火焰近处并经过烧灼进行。w培养瓶培养瓶w滴管、试管、吸管滴管、试管、吸管细胞培养的实验用品细胞培养的实验用品 w细胞培养瓶细胞培养瓶 w25平方厘米，正方斜颈平方厘米，正方斜颈w25平方厘米，三角斜颈平方厘米，三角斜颈w75平方厘米，正方

10、斜颈平方厘米，正方斜颈w75平方厘米，三角斜颈平方厘米，三角斜颈w150平方厘米，正方斜颈平方厘米，正方斜颈 w细胞培养板细胞培养板w 6孔，孔，w12孔，孔，w24孔，孔，w48孔孔w96孔孔w细胞培养皿细胞培养皿w 35mmw 60mm w100mm w冻存管w1.2ml w2ml，w5mlw离心管离心管w 15mlw 50mlw细胞刮细胞刮滤滤 器器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。酶液等均采用滤过法除菌。液氮罐何处购买细胞何处购买细胞wATCC 细胞库细胞库().w美国菌种保藏中心又称美国模式

11、菌种收集中心美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。非赢利性组织。w目前它可以提供以下物品目前它可以提供以下物品 细胞系细胞系3000种种 细菌和噬菌体细菌和噬菌体 15000种种 动植物病毒动植物病毒 2500种种 原生动物原生动物 1200种以及重组物品种以及重组物品 w欧洲动物细胞库欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库和日本细胞库(RCB) 国内细胞库中国科学院细胞库中国科学院细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：联系方法：地址：

12、上海市岳阳路地址：上海市岳阳路320号，号，200031电话：电话 54920405Fax:系人：陈松华，徐惠均联系人：陈松华，徐惠均e-mail: whttp:/ 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物养物/生物材料菌种保藏机构生物材料菌种保藏机构订购程序订购程序w向中心订购培养物，可查阅向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。保藏号等内容。w联系方式可通过电话、传真，

13、信函，电子邮件等方式。联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：电话传真：传真E-mail:w细胞系：细胞系：300500元元/每株每株 w菌种准备时间菌种准备时间 一般情况一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。送二次（周一，周五）。细胞的营养细胞的营养w碳水化合物、氨基酸和脂类碳水化合物、氨基酸和脂类三大类三大类w也需要一定量的无机盐、维也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素生素和微量元素细胞培养液细胞培养液 w水水w平衡盐溶液平衡盐溶液 wpH调

14、节液调节液w消化液消化液w抗生素溶液抗生素溶液w培养基培养基 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水桶装水：怡宝桶装水：怡宝细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制平衡盐溶液平衡盐溶液w主要由无机盐和葡萄糖配制而成主要由无机盐和葡萄糖配制而成w作用作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 w常用的缓冲液常用的缓冲液 生理盐水生理盐水 PBS Hanks液液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）常用于配制胰酶溶液） pH调节液调节液(1) 碳酸氢钠液碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中是一种可以保持细胞培养过程中pH值较

15、长时值较长时间稳定的氢离子缓冲剂间稳定的氢离子缓冲剂通常使用浓度为通常使用浓度为1015mM 消化液消化液胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来落并使细胞游离分散开来 常用浓度为常用浓度为0.25%或或5%胰蛋白酶。胰蛋白酶。(2) EDTA溶液溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助

16、溶，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液胶原酶溶液(1) 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。 抗生素溶液抗生素溶液w通常是通常是青霉素青霉素和和链霉素链霉素联合使用，俗称联合使用，俗称“双抗双抗溶液溶液”。w青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升培养

17、基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。单位。庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升100单位单位 培养基培养基w分天然培养基和合成培养基分天然培养基和合成培养基w天然培养基天然培养基： 血清血清 血浆血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 合成培养基合成培养基 w根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。工方法模拟合成的。w包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物碳水化合物w目前常用培养基：目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、w另

18、有无血清培养基、无蛋白培养基另有无血清培养基、无蛋白培养基RPMI1640w最初是由最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细为培养小鼠白血病细胞而设计的。胞而设计的。w开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至、直至RPMI1640。w其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。w尤其适合人白细胞，如尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-6

19、0、IM-9、Jurkat、 K-562 及及KATOIII等细胞系等细胞系的培养。的培养。RPMI1640种类种类wRPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）wRPMI1640（A）无酚红）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌）（不含谷氨酰胺、高压灭菌）wRPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）（含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）DMEM细胞培养基细胞培养基w 是在是在MEM培养基的基础上研制的培养基的基础上研制的w与与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于于4500g/L）和低糖型）和低糖型(低于低于

20、1000g/L)。w高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。着较困难肿瘤细胞等。 w DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。干粉培养基的配制干粉培养基的配制 w认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸

21、钠、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分等。这些成分有些是必须添加的，如有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。需要决定。w配制是要保证充分溶解，配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。培养基完全溶解之后才能添加。w配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。w 所用器皿应严格消毒。所用器皿应严格消毒。 w配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。度。 血清的使用血清的使用w血清质量好坏是实验成败的关键血清

22、质量好坏是实验成败的关键w常用血清常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。w优质血清的标准优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。体、病毒污染。w血清的灭活（消除补体活性）血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。分钟。w血清的消毒血清的消毒 过滤除菌。过滤除菌。牛血清牛血清w胎牛血清应取自剖腹产的胎牛胎牛血清应取自剖腹产的胎牛w新牛血清取自出生新牛血清取自出生24小时之内的新生牛小时之内的新生牛w小牛血清取自出生

23、小牛血清取自出生1030天的小牛天的小牛w使用浓度：使用浓度： 一般为一般为520，最常用是，最常用是10 何谓何谓FBS、FCS、 CS、HS ?wFBS (fetal bovine serum) 和和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，是相同的意思， 两者都是指胎牛血清，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，乃错误的使用字眼， 请不要再使用。请不要再使用。wCS (calf serum) 则是指小牛血清则是指小牛血清wHS (horse serum) 则是指马血清则是指马血清血清解冻步骤血清解冻步骤w逐步解冻法逐步解冻法 20 或或70 至至4 冰箱溶解一

24、天，至冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离无菌离心管可分装心管可分装4045 ml。w勿直接勿直接由由20 至至37 解冻，因温度改变太解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 无机盐无机盐wCaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4w对调节细胞渗透压、某些酶的活性对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。及溶液的酸碱度都是必须的。 氨基酸氨基酸 w缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸蛋

25、、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型型)w细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成其他氨基酸或糖类转化合成w谷氨酰胺谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺谷氨酰胺 。wL-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性于一些细胞具有毒性 。 休息一会儿吧！休息一会儿吧！w伸伸腿，弯弯腰！体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 贴附型贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：赖性细胞，大致分成以下四型：w成纤维细胞成

26、纤维细胞w上皮型细胞上皮型细胞w游走细胞型游走细胞型w多型细胞型多型细胞型1、成纤维细胞型、成纤维细胞型名称：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2323个长短不个长短不等等 的突起，中有卵圆形核的突起，中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状 细胞细胞细胞接触易断开而细胞

27、接触易断开而单独行动，单独行动，游离的单独的成纤游离的单独的成纤维维 样细胞，常有几个伸长的样细胞，常有几个伸长的细胞突起细胞突起成纤维细胞成纤维细胞 HUVECs人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：培养的天数：4d；原代培养；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+15胎牛胎牛 血清；血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。形，扁平形或多角形，贴壁生长。 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人

28、骨髓间充质干细胞原代；细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：培养天数：7天；天；3.放大倍数：放大倍数：200倍，倒置显微镜；倍，倒置显微镜；4.培养基种类：培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用细胞状态与特征简述：使用percoll密度密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。 2、上皮型细胞、上皮型细胞名称：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层、内胚层细胞、内胚层细胞, 如：如

29、： 皮肤及其衍生物皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似体内的类似体内的上皮细胞扁平上皮细胞扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆，中有圆形核形核 生长特点：生长特点：易相连易相连成片，成片，相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状生长生长时呈时呈膜状膜状移动，移动，很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动上皮型细胞上皮型细胞 SKOv3 （卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生

30、 长，生长速度较快。 CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。和其他细胞相区别。 CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；细胞种类：高分化鼻咽癌细胞

31、系；2.培养的天数：培养的天数：3d；3.放大倍速：相差放大倍速：相差100；4.培养基种类：培养基种类：PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。梭型成团生长。 4、多型细胞型、多型细胞型w有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。稳定的形态，可统归于此类。 SD大鼠神经元大鼠神经元 原代原代1.细胞种类：脑皮质细胞；细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数：培养的天数：4-5天；天；3.放大倍速：电镜放大倍速：电镜20000；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%

32、小牛血清小牛血清+10%马马 血清；血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。突和树突。悬浮型悬浮型概念：概念：培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：特点：在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好细胞细胞圆形圆形，单个或小细胞团，单个或小细胞团优点：优点：生存空间大，生存空间大，提供数量大，传代方便提供数量大，传代方便( (不需消化不需消化) )，易于收获，易于收获，可获得稳定状态可获得稳定状态缺点：缺点：观察不方便，很多细

33、胞不能悬浮生长观察不方便，很多细胞不能悬浮生长( (尤以正常细尤以正常细胞胞) ) HL-60 分化细胞分化细胞Giemsa染色染色1. 细胞种类：细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：培养的天数：ATRA 1微摩尔作用微摩尔作用5天；天；3. 放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养基种类：培养基种类：1640+8胎牛血清；胎牛血清；5. 细胞状态与特征简述：细胞状态与特征简述：悬浮细胞悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。消失，胞核呈杆状或分叶状。 KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系

34、；细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。 HeLa细胞细胞1.细胞种类：人细胞种类：人HeLa细胞传代培养；细胞传代培养；2.培养的天数：培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。细胞状态与特征简述：细胞呈

35、多角形，贴壁生长。 K562细胞细胞1.细胞种类：细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后培养的天数：传代后2天；天；3.放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。 每代贴壁细胞的生长过程每代贴壁细胞的生长过程w游离期游离期w贴壁期贴壁期w潜伏期潜伏期w对数生长期对数生长期w停止期（平台期）停止期（平台期）w游离期游离期 悬浮

36、，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。w吸附期吸附期 贴附底物，一般贴附底物，一般24小时内贴壁。小时内贴壁。w潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为624小时。小时。w对数生长期对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。行实验研究。w停止期（平台期）停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性根据细胞生长的恃点，

37、传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种：种：1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/ /分分）去上清，沉淀物加新）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。培养液后再混匀传代。 2 2半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（HelaHela细胞）细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3 3贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。采用酶消化法传代。 常用的消化液有常用的消化

38、液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。细胞传代方法细胞传代方法首次传代注意事项首次传代注意事项w细胞生长密度不高时，不能急于传代细胞生长密度不高时，不能急于传代 w原代培养的贴壁细胞需控制消化时间原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 w吹打已消化的细胞应减少机械损伤吹打已消化的细胞应减少机械损伤 w首次传代时细胞接种数量要多一些首次传代时细胞接种数量要多一些 w首次传代培养的首次传代培养的pH应偏低些应偏低些 w小牛血清浓度可加大至小牛血清浓度可加大至15%20%左右左右 细胞计数细胞计数w计数结果以每毫升细胞数表示w细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同w血细胞计数器：手工计数细胞wCo

39、ulter计数仪：人工计数细胞计数步骤细胞计数步骤w1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。w2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。片和计数板之间。w3、静置、静置3分钟。分钟。w4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数细胞数/ml4大格细胞总数大格细胞总数/ 4104注意注意：压线细胞只计：压线细胞只计左侧左侧和和上方上方的。的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，镜下偶见由两个以上细

40、胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养细胞活力测定培养细胞活力测定w细胞活力：细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比总细胞中活细胞所占的百分比w由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。解分离的过程对细胞是否有损伤作用。w复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。苏的效果。测定方法测定方法w台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。w流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染

41、料的通透性，代谢活性，膜电位等。 3四唑盐（MTT）比色法w四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；wMTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 （formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏w细胞深低温保存的基本原理是：细胞深低温保存的基本原理是： 在在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。即代谢处于完全停止状态，故可