海洋生物技术—海洋动物细胞培养定稿

1、海洋生物技术海洋动物细胞培养定稿一、细胞工程与细胞培养 细胞工程细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。学科。 细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目

2、的：获得新性状、新个体、新物质目的：获得新性状、新个体、新物质1 细胞工程的定义细胞工程的定义2 细胞工程的研究范畴动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程转基因生物与生物反应器n植物植物n分化成熟的植物细胞体，仍有可能发育成完整植株。n动物动物n随着分化的演进，分化成熟细胞逐渐丧失其分化潜能,不能发育成为完整的动物个体。n实验证明，囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，保持着全套基因组的细胞核仍具有全能性可能发育成完整个体。n细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。决定动物细胞全能性的关键在于细胞质。植物体细胞具有全能性动物细胞培养技术

3、的发展或动物胚胎或动物胚胎分散成单个细分散成单个细胞胞一定浓度的细胞一定浓度的细胞悬浮液悬浮液原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养遗传物质改变遗传物质改变传代培养传代培养细胞株细胞株：原代细胞和原代细胞和50代前的传代细胞叫做细胞代前的传代细胞叫做细胞株。株。细胞系细胞系：50代后，遗传物质发生了改变，并代后，遗传物质发生了改变，并且有癌变的特点，无限传下去的传代细胞。且有癌变的特点，无限传下去的传代细胞。细胞株细胞株 细胞系细胞系 原代培养原代培养 传代培养传代培养合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。(1)氨基酸 必需氨基酸是

4、动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必需氨基酸，另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不同。有时也加入其他非必需氨基酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可影响细胞存活的生长速率。在细胞培养中，大多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源。(氨基酸为L型)(2)维生素 Eagle基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血清中取得。血清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，它们也必不可少。维生素限制可从细胞存活和生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标。(3)碳水化合物 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋

5、白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等。(4)无机盐 无机盐是细胞的重要组成部分之一，它们积极参与细胞的代谢活动。无机盐中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透压的主要成分。对悬浮培养，要减少钙，可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相CO2浓度有关。(5)有机添加剂 复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等及其他各种化合物。同样，当血清量减少时，必须添加这种化合物，它们对克隆和维持这些特殊细胞有益。(6)血清 组织细胞培养中常用的天然培养基是血

6、清。这是因为血清中含有大量的蛋白质、核酸、激素等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。最常用的是小牛血清，胎牛血清。人血清用于一些人细胞系。大多数动物细胞培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，细胞可在无血清条件下维持和增殖。 目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趋于简单化，以能维持细胞生长的最低需求，而去除了不必要的成份。同时为适应某些特殊培养的需要补加一些新的成分，如培养杂交瘤细胞时采用DMEM培养基需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇；为增加细胞转化和DNA合成，有时补加植物血凝素(PHA)等。这些变化需根据实验和细胞的具体

7、要求而定。培养方法和环境要求培养方法和环境要求（一）培养的方法动物细胞的体外培养有两种类型：1.贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞部属于这一类型。这一类需采用贴壁培养。贴壁培养贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于

8、实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。2.非贴壁依赖性细胞，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于这一类型。这一类可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。悬浮培养悬浮培养是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再

9、分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。1、分批式培养(Batch culture)分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。在细胞分批培养过程中，不向培养系统补加营养物质，而只向培养基中通入氧，能够控制的参数只有pH值、温度和通气量。因此细胞所处的生长环境随着营养物质的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优的条件下，因而分批培养并不是一种理想的培养方式。分批培养过程特征如图

10、 2、分批补料式培养(Fed-batch culture)分批补料式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。分批补料式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。由于分批补料式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。3、半连续式培养(Semi-continuous culture)半连续式培养是在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培

11、养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。 4、连续式培养(Continuous culture)连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。与分批式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处环境条件长时间地稳定，可以使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的生长和产物的形成。由于连续式培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。 连续培养一般是采用灌注培养：灌注培养灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续往反应器中加入新鲜的培养基，同时

12、又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞足够的营养以及除去有毒的代谢物。灌注培养时用新鲜培养液进行添加，确保上述目的实现。通过调节添加速度，则使培养保持在稳定的、代谢副产物低于抑制水平的状态。采用此法，可以大大提高细胞的生长密度，有助于产物的表达和纯化。由于连续培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，因此，在生产中广泛被采用。如英国Celltech公司采用灌注培养杂交瘤细胞，连续不断地生产单克隆抗体，获得巨大经济效益。虽然灌注培养具有不少优点，但也存在培养基消耗量比较大，操作过程复杂

13、，培养过程中，易受污染等缺点。（二）细胞培养的环境要求细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质，在很大程度上受各种环境因素的影响。为了使动物细胞反应处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的。影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等方面。 1、支持物 体外培养的大多数动物细胞需在人工支持物上单层生长。在早期的实验中，用玻璃作为支持物，开始是由于它的光学特性，后来发现它具有合适的电荷适合于细胞贴壁和具有合适的电荷适合于细胞贴壁和生长生长。 (1) 玻璃 玻璃常用作支持物。它很便宜，容易洗涤，且不损失支持生长的性质，可方便地用于干热或

14、湿热灭菌，透光性好，强碱可使玻璃对培养产生不良影响，但用酸洗中和后即可。 (2) 塑料制品 一次性的聚苯乙烯瓶一次性的聚苯乙烯瓶是一种方便的支持物。但制成的聚苯乙烯是疏水性的，但它不适合于细胞生长它不适合于细胞生长，所以细胞培养用的塑料用品要用用射线、化学射线、化学药品或电弧处理使之产生带电荷的表面，具有可润湿性药品或电弧处理使之产生带电荷的表面，具有可润湿性。它光学性质好，培养表面平。除此之外，细胞也可在聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和其他塑料上生长。 (3) 微载体 大规模动物细胞贴壁培养最常用的支持物是微载体。其材料有聚苯乙烯、交联葡萄糖、聚丙烯酰胺、纤维素衍生物、几聚苯乙烯、交联葡萄糖

15、、聚丙烯酰胺、纤维素衍生物、几丁质、明胶丁质、明胶等。通常用特殊的技术制成100200m直径的圆形颗粒，微载体的制备是一种较复杂的技术，微载体的价格一般也比较贵。但它的最大优点是使贴壁细胞可以像悬浮培养那样进行。微载体表面光滑，有的还在表面深层，使表面带有少量正电荷，适合于细胞贴附。 支持物通过各种预处理后，可改善细胞的贴壁和生长性能。用过的玻璃容器比新的更适合细胞生长。这可能归因于培养后的表面的蚀刻和剩余的微量物质，培养瓶中细胞的生长也可以改善表面以利第二次接种，这类调节因素可能是由于细胞释放出的胶原或黏素。 2、气体交换 (1)氧气 气相中的重要成分是氧气和二氧化碳。各种培养对氧的要求不同

16、，大多数动物细胞培养适合于大气中的氧含量或更低些。据报道，对培养基硒含量的要求与氧浓度有关，硒有助于除去呈自由基状态的氧。在大规模细胞培养中，氧可能成为细胞密度的限制因素。 (2)二氧化碳 二氧化碳对动物细胞培养起着相对复杂的作用，气相中的C02浓度直接调节溶解态C02的浓度，溶解态的C02受温度影响，C02溶于培养基中形成H2C03，产生H2C03又能再离解： 由于HCO3-与多数阳离子的离解数很小，趋于结合态，故使培养基变酸。提高气相中CO2含量的结果是降低培养液pH值，而它又被加入NaHC03浓度所中和： 若HCO3-浓度增加，则式(14-18)平衡向左边移动，直到系统在pH=7.4达到

17、平衡。如果换用其他物质，如NaOH，实际效果是一样的：2.2 鱼类组织或细胞的来源鱼类的很多组织和器官均可用于进行细胞培养，但比但比较常用的是鱼类的胚胎组织和幼鱼的组织器官。由较常用的是鱼类的胚胎组织和幼鱼的组织器官。由于这些组织和器官的分化程度低，分裂潜能大于这些组织和器官的分化程度低，分裂潜能大，所以是用于鱼类原代细胞培养的最佳材料。成鱼的性腺、肾、心、鳔、脾脏、鳍条、吻端性腺、肾、心、鳔、脾脏、鳍条、吻端等也是比较常用的培养材料，尤其是性腺与肾脏性腺与肾脏的应用最为广泛。2.3 鱼类细胞培养的方法与技术 目前较常用的原代培养的方法是：组织块法、机械分散法、络合剂分散法和酶消化法。组织块法：当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约1mm3的小块，按一定比例将组织块涂布在瓶壁上(每个25ml的细胞培养瓶约涂布25块组织块)，经4-5h细胞贴壁后，轻轻加入适量的培养基，放入CO2培养箱培养。机械分散法：适用于细胞间连接较松散的组织，如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约1mm3的小块，放入底部有一铜网的注射器内，用压力将组织挤出网孔，最后将分散的组织吹打后加入培养基，分装，放入CO2培养箱培养。络合剂分散法：目前使用的络合剂主要是EDTA(乙二胺四乙酸)，它能与细胞间的钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散，经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。