整理WesternBlottingProtocol-中山大学参考

1、WesternBloting（张雪雁）操作步骤:1 .做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml,灌胶、插梳子，赶走气泡。2 .蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加B一琉基乙醇，然后以PCR仪95c变性10分钟。3 .上样、电泳：1）上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。以蒸储水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。2）将SDS-PAGE交转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。1x电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量

2、赶除。3）先以少量加有澳酚蓝1x上样缓冲液标记各泳道。4）变性过的各管蛋白质样品以加有澳酚蓝1x上样缓冲液补齐至50ulo蛋白Marker也补齐至50ulo5）以一定顺序将蛋白样品和Marker,用微量移液器加至泳道。上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。6）加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。澳酚蓝自胶内跑出后电泳结束。4 .电转：1）准备PVDF膜及滤纸。PVD次小8.2x55

3、.5,滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。2）将PDVF!置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡13分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。3）小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF1一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。一般小分子量适合低电压，大分子量适合高电压。5 .封闭：1）电转完毕后取出PVD映，置于5%勺脱脂奶溶液中封1一小时或者4c过夜。2 ）一抗反应：将抗体以10

4、ml5%兑脂奶适合稀释，将PVD瞰浸入其中，置于脱色摇床上促进反应1小时。表达丰度低的蛋白可适当加长时间，比如4c冷库过夜。6 .回收抗体。7 .TBST液摇洗膜，15分钟x3次8 .二抗反应：相应二抗以1:2000比例稀释至10ml。PVDF1置于其中要洗4050分钟。9 .TBST液洗膜，15分钟x3次10 .暗房发光洗片。所需物品：滤纸，X鲜膜，压片盒，X光片，小银子，1000ul移液器，枪头，配制发光液，solutionI:solutionn=1:1,一张膜需要2ml。1）用纸吸干PVD缺水分，在保鲜膜上浸泡于发光液1分钟，期间用银子翻转几次促进均匀反应。用纸吸干PVD映上剩余的发光液

5、，裹于干净的保鲜膜里，只需一层。2）PVD映平铺于压片盒，关灯，取X光片12张铺与其上，扣紧压片盒。根据需要定制曝光时间。一股第一张15分钟。将剩余X光片密封避光保存妥善。3）取出压片盒中X光片投入自动洗片机中冲洗。WesternBloting相关试齐U：(Bio-Rad161-0101)Acrylamide/Bisacrylamide30%(w/v)acrylamide(丙烯酰胺)0.8%(w/v)methelenebisacrylamide(N-N'亚甲基双丙烯酰胺)丙烯酰胺(Acr)29g亚甲基双丙烯酰胺(Bic)1g超纯水至100ml37c下溶解后，4Cbrownbottle保

6、存，使用时恢复至室温且无沉淀。4xLowerTris500mlTrisbase(1.5M,m.w.121.1)90.83g10%SDS20ml超纯水至500mlPHto8.8(aboutHCL12ml)4xUpperTris,200mlTrisbase(0.5M)12.12g10%SDS8ml超纯水至200mlPHto6.8(aboutHCL8ml)10%AmmoniumPersulfate(过硫酰胺，APS,10%,W/V)总量10mlAmmoniumPersulfate1gDH0to10ml溶解后，分装后-20C保存，每次用一支(200ul),保存时间为一周(Gibco155-16-024

7、)(Bio-Rad161-0800)Temed:，Glycerol10ml20%SDS15ml4xUpperTris12.5mliH2Oto50ml1xSampleBuffer1.5ml2ml3ml4ml5ml10ml20ml50mlH2O(ml)0.6750.91.351.82.254.5922.52xS.B.(ml)0.7511.522.551025BME(ul)751001502002505001000250010xRunningBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)576g288g144gTrisbase(GIBCOBRL15504-038)120g60g30g

8、SDS(GIBCOBRL15525-017)40g20g10g加dHO至相应的容量。1xRunningBuffer10xRunningBuffer和dHO按1:9比例配置，溶解后室温保存；溶液可置于4c重复使用3次10XTransferBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)580g290g145gTrisbase(GIBCOBRL15504-038)116g58g29g加dHO至相应的容量1XTransferBuffer,2000mldH2O1400ml;20%methanol（甲醇）400ml1XTransferBuffer200ml混匀。溶解后室温保存；溶液可置于4

9、c重复使用3次。10XTBS（PH7.6）4L2L1LTris96.8g48.4g24.2gNacl320g160g80g36%HCL5058ml1XTBS-T,2000mldH2O1800ml1XTBS200ml吐温-202ml（或20%±温10ml）（临时加入），混匀1XTBS缓冲液（可参考）1mol/LTrisHCL（PH7.5）10mlNaCl8g蒸储水至1000ml10XPBS4L2L1LNacl320g160g80gKCL8g4g2gNkHPO57.6g28.8g14.4gKHPO9.6g4.8g2.4g加dHO至相应的容量0.01mol/LPBS缓冲液(ph7.2-7.

10、4)(可参考)0.2mol/LNaH2PO19ml0.2mol/LNa2HPO81ml蒸储水至2000mlStrippingBuffer10ml50ml100ml200ml500ml1mol/vTrisHCL(PH6.7)(ml)0.6253.1256.2512.531.2510%SDS(ml)210204010014.4mol/lB-筑基乙醇0.070.350.71.43.5dH2O(ml)*7.305*36.525*73.5*146.1*365.25*力口dHO至相应的容量。B-琉基乙醇在Strip前临时加入。配置时，在通风厨内进行。4c保存，可重复使用1次（Stripping步骤：用St

11、rippingBuffer在50c洗膜10min,之后于室温下在TBST中洗膜3次，每次10min.封闭后开始加相应抗体）附：其他部分试剂配制：母液1mol/LTrisHCLTris（MW121.14）30.29g蒸储水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至所需点（如下所示），最后用蒸储水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。PHHCL7.4约17ml7.5约16ml7.6约15ml8.0约10ml1.74mg/ml(10mmol/l)PMSFPMSF0.174g;异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，一20C保存。0.2mol/lNaH2PO4NaHPO(MW119.98)12g蒸

12、储水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/lNa2HPO4NaHPO12HO(MW358.14)71.6g蒸储水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。10%SDSSDS10g蒸储水至100ml50c水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用10%过硫酸胺(AP)过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4c保存，保存时间为一周。TrisHCL(PH8.8)Tris(MW121.1415.13g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。0.5mol/lTrisHCL(PH6.8)Tris(MW12

13、1.14)15.14g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。20%Tween2020ml100mlTween20蒸储水至使用液单去污剂裂解液(50mol/lTris1mol/lTrisHCL(PH8.0)NaCLTritonX-100混匀后，4c保存HCL(PH8.0),150mmol/lNaCL,1%TritonX-100,100ug/lPMSF:2.5ml0.438g0.5ml混匀后，4c保存。使用时，加入PMSF®终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50ul）G250考马斯亮蓝溶

14、液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G25Q100mg95%>50ml磷酸：100ml蒸储水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4c保存0.15mol/lNaClNaCL（MW58.44）0.877g蒸储水至100ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/lNaCl1ml溶解后，-20C保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/lNaCL进彳T100倍稀释1mg/ml,-20C保存还原型5XSDS上样缓冲液(0.25mol/lTris?HCL(PH6.8),0.5mmol/l二硫叔糖醇，10

15、%SDS,0.5%I酚蓝，50%T油)0.5mol/lTris?HCL(PH6.8)2.5ml0.5mmol/l二硫叔糖醇0.39gSDS0.5g澳酚蓝0.025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4c保存10X丽春红染液三氯乙酸30g磺基水杨酸30g蒸储水至100ml使用时将其稀释10倍。封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉2.5gTBST50ml溶解后4c保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用显影液（5X）自来水(50c60C)700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g亚硫酸钠（无水）15g冰乙酸12.6ml硼酸7.5g水温

16、冷至30c以下再加入）钾明研15g（加水定容至1000ml,室温保存。WesternBlotting配胶6%SsperationGel7.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)123415L.T.(ml)1.252.53.75518.75Acry1(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.725.438.1510.8740.75L.T.(ml)1.252.53.75518.75APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138HaO(ml)2

17、.474.937.49.8737APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13385ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)1.534.5622.5L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.724.46.68.833APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)1.753.505.257.0026.25L.T.(ml)1.252.53.75518.75HbO(ml)246830APS(ul)26

18、.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13389%SsperationGel10.5%sperationGel12%SsperationGel13.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)246830L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)1.733.745.206.9326.00APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)2.254.56.75933.75L.T.(ml)1.252.53.75518.75HbO(ml)1.472.934.45.8722APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.133815%SsperationGelStackingGel5ml10ml15ml20ml75mol2ml4ml5ml8ml30mlAcry1(ml)2.557.51037.5Acry1(ml)0.220.440.660.883.3L.T.(ml)1.252.53.75518.75U