脓汁和粪便标本中病原菌的检测-3)

1、斜面斜面4 4支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）器材准备器材准备空气细菌检查结果分析空气细菌检查结果分析 v细菌菌落直径13mm，有光滑型、粗糙型、粘液型。v霉菌菌落比较大，呈棉絮状、绒毛状。v计数菌落形成单位（CFU）,报告结果。37培养24小时培养72小时培养48小时空气的细菌学检查（结果录入）空气的细菌学检查（结果录入）组号采样时间(min)采样地点菌落形成单位(CFU)1152153154155156157158159151015CFU /mCFU /m3 3 50,000N50,000NAT 86N(AT 86N(直径

2、直径7cm7cm平板）平板）N：平板上的菌落数 A：平板面积(38.5cm2)T：采样时间(15分钟) CFU：colony forming unit WHO推荐的医院各部门空气细菌标准级别cfu/m3适用范围级区10器官移植、心血管、矫形等外科手术室，保护性隔离室，灌注或配制注射液实验室级区200无菌室、手术室、供应室、婴儿室、中心灭菌单位、术后恢复室、早产儿及产房、重症监护病房级区200500一般病房、治疗室、放射室、衣帽室、按摩室、盥洗室、手术室浴室我国公共场所空气卫生细菌学标准（GB96639673-1996，GB16153-1996,平皿直径9cm）撞击法cfu/m3沉降法个/皿适用

3、范围1000 1035星级宾馆、饭店1500 202星级以下宾馆和非星级带空调宾馆、饭店2500 30普通饭店、招待所、酒吧、茶座、咖啡厅、图书馆、博物馆、美术馆、飞机客舱4000 40音乐厅、影剧院、游艺厅、舞厅、理发店、美容院（店）、游泳馆、体育馆、医院候诊室、候机室、旅客列车车厢、轮船客舱、饭馆（餐厅）7000 75展览馆、商场（店）、书店、候车室、候船室1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤的细菌学检查甲和乙、丙和丁共用1个平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 手指皮肤细菌检查结果分析手指皮肤细菌

4、检查结果分析 v比较洗手前后细菌的种类。洗前细菌种类多。洗后细菌种类少。洗手能洗掉大多数暂住菌。 v比较常规和标准洗手的细菌数量。常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。标准洗手，平板上细菌数量多。常住菌数量大，牢固附着在皮肤上，常洗不掉， 可洗松动，经摩擦接种、脱落到培养基上，显示细菌更多？外科手术人员洗手？ v碘酒和酒精棉球消毒以后，有没有细菌生长？v空白对照有没有细菌生长？医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（三）菌落特征观察P11细菌纯培养P10油镜使用方法（讲解）脓汁和粪便标本检验（录像）菌落特征 Colony Characteristicsv大小：大(直径约3mm

5、以上)，中(直径约13mm)，小(直径约1mm以下)。v形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。v边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。v表面：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、湿润或干燥。v色素：一般为无色或灰白色，特殊色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培养基不着色)和水溶性色素(菌落及培养基均着色)。v溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不透明)，溶血(菌落周围出现透明环)。金黄色葡萄球菌菌落特征X-SA 琼脂培养基添加了显色酶基质，金黄色葡萄球菌形成淡蓝色菌落 。血琼脂菌落直径约2mm、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐，菌落周围有透明的溶血环，溶血菌株大多有

6、致病性。 Baird-Parker琼脂菌落黑色，奶油状，表面光滑，湿润，圆形，凸起，有光泽，边缘整齐，不透明，外层有一透明圈 。伤寒沙门菌菌落特征HE琼脂Hektoen Enteric Agar沙门菌产生蓝绿色、黑色中心菌落 XLD琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂Xylose Lysine Desoxycholate Agar沙门菌产生较小黑色菌落SS琼脂Salmonella Shigella Agar沙门菌产生较小黑色菌落埃希菌产生较大红色菌落 链球菌菌落特征血琼脂甲型溶血性链球菌，菌落周围有12mm宽的草绿色溶血环，称甲型溶血或溶血。血琼脂乙型溶血性链球菌，菌落周围有24mm宽、红细胞完全溶解、

7、透明的溶血环，称乙型溶血或溶血。血琼脂丙型链球菌，不产生溶血素，菌落周围无溶血环，称不溶血性链球菌或溶血。甲型乙型丙型志贺菌菌落特征HE琼脂Hektoen Enteric Agar形成不发酵乳糖的深绿色菌落。麦康凯琼脂MacConkey Agar 形成较小的，无色半透明不发酵乳糖的菌落。SS琼脂Salmonella Shigella Agar 菌落圆形、液滴状、边缘整齐，湿润，无色半透明。大肠埃希菌菌落特征麦康凯琼脂MacConkey Agar伊红美蓝琼脂eosin methylene blue Agar 科玛嘉显色琼脂CHROMagar 细菌的纯培养 Pure Culturesv脓汁标本在普

8、通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。37培养24小时 v粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径23mm。致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，淡粉红色，半透明，直径12mm。37培养24小时 v若培养、放置时间过长或者平板上某个部位细菌比较多、菌落比较密集，大肠杆菌菌落颜色可能会发生改变。因为大肠杆菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白

9、质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸。大肠杆菌菌落可能会由原来的紫黑色变成粉红色，或者菌落中心黑色，边缘粉红色。由紫黑色变成粉红色菌落中心黑色，边缘粉红色。大肠埃希菌菌落特征菌落特征改变若划线分离不成功，菌落数量少的，或者菌落分布密集的，获得菌落形成单位的可能性比较大。划线分离成功的，菌落分布越往后越稀疏的，获得单菌落可能性越大。斜面接种分工v甲普通平板黄色黄色菌落1支斜面 v乙普通平板白色白色菌落1支斜面 v丙 EMB平板紫黑紫黑菌落1支斜面 v丁 EMB平板粉红粉红菌落1支斜面 斜面正面上正面上2/32/3作标记：组号、黄色、白色、紫黑、粉红。选择平板上相同的菌落数多的

10、、典型的、容易挑取的单菌落。在平皿底部玻璃上，画个大圈选取菌落，得到同组同学认可，才能挑取。画圈选菌落画圈选菌落甲甲黄色黄色丙丙紫黑紫黑乙乙白色白色丁丁粉红粉红接种环接种环套住菌落套住菌落轻刮取菌轻刮取菌斜面接种法 Streak Slant Method甲黄色, 乙白色。丙紫黑, 丁粉红。标记：组号，颜色 接 种 环 取菌 后 ， 伸 入斜 面 底 部 ，自 下 向 上 先拉 一 条 细 菌接种线。再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。细菌涂布接种在斜面培养基的表面。生物安全警告v接种环接种斜面一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通

11、过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。灭菌 收集平板 灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置） 速送灭菌室 高压蒸汽灭菌 洗刷。奥林巴斯 CX21型 生物显微镜使用须知v显微镜是精密光学仪器，请不要让其受到撞击，请小心操作。v在搬运显微镜时，请按右图所示，以双手抓住镜臂孔的两侧，小心搬运。如果拿住载物台和镜筒等部位搬运的话，有可能会造成损坏。开关与调整光强v开或关之前，必须将亮度调整旋钮按箭头相反相反方向转动到最小

12、最小位置位置，以免损坏灯泡。v电源开关拨到 侧为开，拨到侧为关闭。v按箭头方向转动亮度调整旋钮变亮，相反方向转动则变暗。聚焦v从显微镜的侧面观察，按箭头方向转动粗调旋钮，使物镜尽可能接近接近标本。一边看目镜，一边慢慢逆逆箭头方向转动粗调旋钮， 使载物台下降下降。v看到标本以后，用微调旋钮来正确对焦。10倍物镜的工作距离工作距离（WD，从物镜到标本的 距离）为10.5mm。 油镜的WD为0.13mm。调整聚光镜位置和孔径光阑v用聚光镜上下移动旋钮，将聚光镜转到最上面。v在孔径光阑环上刻有物镜倍率（10倍，100倍等），观察时将与使用物镜相对应的倍率放到正面。转换物镜v旋转物镜转盘，将希望使用的物

13、镜（10倍、100倍）转到标本的上方。100倍浸油物镜使用方法v油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。v旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。v如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过12次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率香柏油折射率n=1.515n=1.515空气的折射率空气的折射率n=1.000n=1.000玻璃的折射率玻璃的折射率n=1.520n=1.520油浸镜的原理光线光线 滴加香柏油可使滴加香柏油可使光线更多进入物镜光线更多进入物镜, ,避避免光线通过折射率低免光线通过折射率低的空气而散失的空气而散失, ,以提高以提高物镜的分辨率

14、物镜的分辨率, ,使物象使物象明亮清晰。明亮清晰。 放大倍数：目镜放大倍数：目镜1010倍倍物镜物镜9090或或100100倍。倍。奥林巴斯奥林巴斯 CX21CX21型型 生物显微镜生物显微镜（实验柜内，实验柜内，每人一台）每人一台）注意：只能横放，不得竖放。注意：只能横放，不得竖放。显微镜油镜的使用P13v10物镜看到标本滴加香柏油100油镜浸泡油中模糊物象细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。v将聚光镜调到最高处；孔径光阑环上刻有的物镜倍率（10，100）必须转到正面，与使用的物镜相对应。v油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。v显微镜罩上防

15、尘罩 横放在实验柜内。(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。医学微生物学实验综合性实验三、一v空气、手指皮肤的细菌学检查结果分析v脓汁和粪便标本中病原菌的检测菌落特征观察P11细菌纯培养P10油镜使用方法（讲解）脓汁标本检验 （录像）肠道致病菌的分离鉴定（录像）试管用毛刷，上试管用毛刷，上下刷洗内壁和管底。下刷洗内壁和管底。字迹用湿纱布，字迹用湿纱布，粘去污粉擦拭。粘去污粉擦拭。管口朝向相同，管口朝向相同，流水冲洗流水冲洗1010次。次。洗干净的试管，洗干净的试管，倒扣在筐内，晾干。倒扣在筐内，晾干。平皿用纱布，旋转擦平皿用纱布，旋转擦拭内外侧，字迹用纱拭内外侧，字迹用纱布粘去污粉擦拭。布粘去污粉擦拭。流水冲洗流水冲洗1010次。逐个次。逐个倒扣在筐内，晾干。倒扣在筐内，晾干。思考题v在微生物学实验中,怎样才能避免杂菌的污染?v空气的卫生标准规定如何?v你的实验结果说明了什么问题?v怎样从