实验一：线粒体和细胞核的制备与观察

1、实验一 线粒体和细胞核的制备与观察细胞内线粒体的超活染色与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验目的实验目的通过动物肝细胞核、线粒体的分离，了通过动物肝细胞核、线粒体的分离，了解解细胞器分离的一般原理和方法细胞器分离的一般原理和方法。掌握用掌握用差速离心差速离心法分离动物细胞核及线法分离动物细胞核及线粒体的技术粒体的技术.了解分级分离细胞核与线粒体的纯度检了解分级分离细胞核与线粒体的纯度检测方法测方法学习线粒体学习线粒体活性染色活性染色技术技术, 观察活细胞内观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布线粒体的形态、数量与分布实验原理实验原理 制备线粒体及细胞核

2、采用组织匀浆在悬浮介质中进行制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心差速离心的方法。的方法。 悬浮介质通常采用悬浮介质通常采用一定一定pHpH的缓冲蔗糖溶液的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。 线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶, ,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B B染料染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色原成无色. . 线

3、粒体线粒体能在詹纳斯绿能在詹纳斯绿B B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布；微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布； 詹纳斯绿詹纳斯绿B B是一种是毒性较小的是一种是毒性较小的碱性染料，能对动植物的细胞或组织在碱性染料，能对动植物的细胞或组织在活活体状态下体状态下进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，它们彼此之间发生吸引作用，染料

4、就被堆积下来。染料就被堆积下来。 细胞核细胞核DNADNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与性，很容易与带正电荷的碱性染料带正电荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，以离子或氢键结合而被染色，此外，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，詹纳斯绿詹纳斯绿B B也能被堆积下来也能被堆积下来而使细胞核呈现而使细胞核呈现蓝色。蓝色。细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验活体染色活体染色活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着活体染色是指对生活有机体的细胞或

5、组织能着色但又无毒害的一种染色方法。色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。构和生理、病理状态。 活体染色活体染色 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体通常把活体染色分为染色分为体内活染体内活染和和体外活染体外活染两类。两类。 体内活体染色：体内活体染色：是以胶

6、体状的染料溶液注入动、植物体内，是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。识别的目的。 体外活体染色体外活体染色( (超活染色超活染色) )：它是由活的动、植物分离出部分它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。胞的某种结构上而显色。 作为活体染色剂作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料，对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。而且总要配成稀淡的溶

7、液来使用。 活体染料多为碱性染料活体染料多为碱性染料, ,如中性红如中性红, ,詹纳斯绿詹纳斯绿B,B,次甲基蓝等次甲基蓝等 对某种细胞器的染色具有专一性对某种细胞器的染色具有专一性, ,如中性红染液泡如中性红染液泡, Janus , Janus green Bgreen B染线粒体。染线粒体。细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验用品实验用品 实验材料实验材料小白鼠肝脏小白鼠肝脏人口腔粘膜上皮细胞人口腔粘膜上皮细胞用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠肝剪成小块放入小烧杯内用吸管吸取生理盐水，反复浸泡冲肝

8、剪成小块放入小烧杯内用吸管吸取生理盐水，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。洗肝脏，洗去血液。 细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品实验用品实验试剂实验试剂0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖+0.01mol/L+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷(Tris)-(Tris)-盐酸缓冲液盐酸缓冲液(pH7.4) (pH7.4) 0.2%0.2%和和0.02%0.02%詹纳斯绿詹纳斯绿B(Janus green B)B(Janus green B)染液染液 生理盐水生理盐水 仪器、用具：仪器、用具：显微镜，高速冷冻离心机显微镜，高速冷冻离心机, ,玻璃

9、匀玻璃匀浆器浆器, ,解剖器具，剪刀，漏斗，尼龙解剖器具，剪刀，漏斗，尼龙网网，刻度离心，刻度离心管管等等细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验内容实验内容1.1.小鼠细胞器小鼠细胞器( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )的分离提取的分离提取2.2.分离提取物分离提取物( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )鉴定鉴定3.3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色1.1.细胞器细胞器( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )的分离提取的分离提取(1(1）获取肝脏：获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠用颈椎脱臼法处死小鼠, ,置于解剖盘中剪开置于解剖

10、盘中剪开腹腔腹腔, ,迅速取出小鼠肝迅速取出小鼠肝, ,称重称重1 1克克放入小烧杯内用吸管吸取放入小烧杯内用吸管吸取预冷预冷的生理盐水洗净血液。的生理盐水洗净血液。(2(2）匀浆：匀浆：将鼠肝将鼠肝剪碎剪碎置于置于预冷预冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液中蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝洗涤数次至鼠肝发白发白。然后置于玻璃匀浆器中，加入。然后置于玻璃匀浆器中，加入1010mlml预冷预冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂( (分次加入分次加入缓冲缓冲液液) )。（。（注：整过程在冰浴上进行注：整过程在冰浴上进行）(

11、3(3）过滤：过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷预冷的小烧杯中。的小烧杯中。实验步骤实验步骤（4）细胞核与线粒体分离：细胞核与线粒体分离：匀浆滤液匀浆滤液8mL，1000g离心离心10min 沉淀沉淀1 1（细胞核及碎片细胞核及碎片）涂片涂片A上清液上清液 1 1( (涂片涂片B, ,鉴定细胞核、线粒体鉴定细胞核、线粒体) )重悬沉淀并洗涤重悬沉淀并洗涤1次次（8mL预冷的预冷的0.25mol/L蔗糖缓蔗糖缓冲液，冲液，1000g 离心离心10min）沉淀沉淀2 2（细胞核及碎片细胞核及碎片）涂片涂片D11000g离心离心10 min沉淀沉淀3 3（线粒体线粒体）涂片涂

12、片E上清液上清液 3 3涂片涂片F F上清液上清液 2 2（涂片涂片C）注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验 取悬液取悬液1 滴，置载玻片滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑一端，取另一边缘光滑的载片，放在悬液滴前的载片，放在悬液滴前面慢慢向另一端推动力面慢慢向另一端推动力移，保持推片与载片移，保持推片与载片30 45角，液滴即沿角，液滴即沿推片散开，推片散开，注意用力平注意用力平稳均匀，稳均匀，载片上便留下载片上便留下一层薄膜。一层薄膜。 涂片示意图涂片示意图2.2.分离提取物分离提取

13、物( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )鉴定鉴定将共将共6 6张张涂片涂片，不待干即滴加，不待干即滴加0.2%Janus greenB0.2%Janus greenB染色染色15-20min15-20min后后, ,盖上盖玻片，镜检盖上盖玻片，镜检l线粒体线粒体呈蓝绿色呈蓝绿色, ,圆形、椭圆或圆形、椭圆或短棒状短棒状颗粒颗粒。如如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色絮状，难以辨果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色絮状，难以辨认认。l细胞核呈细胞核呈深蓝色。深蓝色。l血细胞血细胞不着色。不着色。注意：注意：得到的沉淀物须得到的沉淀物须加加预冷预冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液将蔗糖缓冲

14、液将其悬浮后再装片其悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小，制线粒体装片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。 实验步骤实验步骤细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验步骤实验步骤3.3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察将载玻片将载玻片( (必须十分清洁必须十分清洁) )平放在桌面上，滴平放在桌面上，滴2 2滴滴0.02%0.02%詹纳詹纳斯绿斯绿B B染液于载玻片中央；染液于载玻片中央； 用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘

15、膜处稍用力刮取口腔上皮细胞皮细胞( (粘液状物粘液状物) )，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染色色5-15min (5-15min (注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) )，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干；盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干； 低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成成蓝绿色的颗粒状或短棒状蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体的结

16、构，即为线粒体 。细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验结果实验结果图图2：人口腔粘膜上皮细胞：人口腔粘膜上皮细胞(示线粒体示线粒体)图图1：小鼠肝细胞核：小鼠肝细胞核在光学显微镜油镜下进行观察：在光学显微镜油镜下进行观察：功能功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状颗粒（颗粒（绿色箭头所指）绿色箭头所指）（注意：注意：可见蓝绿色渐渐变淡现象，可见蓝绿色渐渐变淡现象，蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失全或功能丧失 ）注：注：红色箭头所指为细

17、胞核红色箭头所指为细胞核细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验图图3：在显微镜下观察到的鼠肝脏离体线粒体在显微镜下观察到的鼠肝脏离体线粒体细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验 匀浆缓冲液预冷(4 ) 冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞 (适度研磨)，缩短匀浆时间。 试验全过程要在04进行,离心机温度设为 4 整个分离过程不宜过长,要尽快。 离心机使用：离心管要平衡 g为离心力(RCF)RCF(g)=1.11810-5 r (rpm)2r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分)注意事项注意事项只有只有3台可用的

18、冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷此，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷.细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验1.1.分别描述六张装片的结果分别描述六张装片的结果( (如如逐级分离中看到哪逐级分离中看到哪些细胞组些细胞组分，分，平均每个视野中所见完整的细胞核平均每个视野中所见完整的细胞核数量数量, ,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少，占多少，等等) )2.2.根据你的实验结果和你所获得的知识根据你的实验结果和你所获得的知识, ,你认为用你

19、认为用此分离方法所分离的线粒体的纯度如何此分离方法所分离的线粒体的纯度如何? ?有什么改有什么改进方法？进方法？3.3.绘出人口腔绘出人口腔粘膜粘膜上皮细胞图上皮细胞图( (示线粒体的形态与示线粒体的形态与分布分布) )实验报告实验报告细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞器分离的过程包括两个主要阶段：细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞破碎细胞细胞组分的分离细胞组分的分离常用的细胞破碎方法常用的细胞破碎方法方方法法技术技术 原理原理效效果果成本成本举例举例机机械械法法匀浆法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎受剪切力而破碎适中适中适中适中动植物

20、组织或细胞动植物组织或细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中便宜便宜植物组织植物组织超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎剧烈剧烈昂贵昂贵细胞悬浮液小规模处理细胞悬浮液小规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞细胞悬浮液和植物细胞大规模处理大规模处理化化学学法法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜血红细胞的破坏血红细胞的破坏酶消化法酶消化法细胞壁或细胞膜被消细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎化，使细胞破碎温和温和昂贵昂贵动植物细胞动植物细胞增溶法增溶法表

21、面活性剂溶解细胞表面活性剂溶解细胞膜膜温和温和适中适中破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞壁有机溶剂溶解细胞壁适中适中便宜便宜甲苯破碎酵母细胞甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细胞碱的皂化作用使细胞壁溶解壁溶解剧烈剧烈便宜便宜破碎大肠杆菌破碎大肠杆菌细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验离心分离技术离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离

22、。分离各种细胞组分的方法主要有：分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心 l速率速率-区带梯度离心区带梯度离心 l等密度离心等密度离心细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验差速离心差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，

23、达到分离不同大小颗粒的目的。较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取常用于其他分离手段之前的粗制品提取 细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验密度梯度离心密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分顶部，通过重力或离心力场的作用使

24、细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为层、分离的方法。这类分离又可分为速率速率- -区区带梯度离心带梯度离心和和等等密度梯度离心密度梯度离心两种。两种。优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。用于较精细的分离。细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验速率速率- -区带梯度离心区带梯度离心和和等密度梯度离心等密度梯度离心原理：原理：根据分离的粒子在梯度根据分离的粒子在梯度液中液中，通过离通过离心力场的作用，使不同的颗粒心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法

25、。带，从而达到彼此分离的方法。A、速率、速率-区带梯度离心流程图区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图、等密度梯度离心流程图原理：原理：根据不同颗粒在密度梯度介质根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着中存在着，在离，在离心力场作心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。力密度的颗粒得到分离的方法。两种密度梯度离心方法的异同两种密度梯度离心方法的异同 特特 点点速率速率- -区带梯度离心区带梯度离心等密度离心

26、等密度离心分离方法的主要依据分离方法的主要依据主要依赖主要依赖分离的粒子在梯分离的粒子在梯度液中度液中依赖于样品颗粒的不同密度来进行依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的离心分离的 介质密度梯度选择介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平粒子的最小密度；梯度平缓缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高度较高 离心介质的主要作用离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围分辨率范围沉降系数相差沉降系数相差20%20%的物的物质质 颗粒密度差异大于颗粒密

27、度差异大于1% 1% 离心后区带形成位置离心后区带形成位置易变易变( (样品易扩散）样品易扩散）不变（样品不扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都离心时间（过长或过短都不利）不利）颗粒样品密度颗粒样品密度一般操作方法一般操作方法介质梯度应预先形成介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心密度梯度溶液表面，离心后形成区带。后形成区带。 介质梯度不需预先制备介质梯度不需预先制备，离心时把，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，入离心管，通过离心自形成梯度通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质常用介质蔗糖蔗糖、甘油、甘油蔗糖蔗糖 、甘油、甘油、 CsClCsCl、硫酸铯、溴、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。化铯、三碘苯衍生物等。 细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验表表1:各种亚细胞构造在各种亚细胞构造在不同的离心介质不同的离心介质中分离所需的中分离所需的离心