第八章特殊毒性及其试验与评价方法(1)

1、NoImageNoImage第八章第八章 特殊毒性试验及其评价特殊毒性试验及其评价第一节第一节 致突变作用及其试验方法与评价致突变作用及其试验方法与评价第二节第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价生殖发育毒性作用及其试验与评价第三节第三节 致癌作用及其试验方法与评价致癌作用及其试验方法与评价NoImageNoImageNoImage第一节第一节 致突变作用及其试验与评价方法致突变作用及其试验与评价方法一、一、 基本概念基本概念二、突变类型二、突变类型三、突变的发生与修复机制三、突变的发生与修复机制四、致突变试验与致突变作用评价四、致突变试验与致突变作用评价NoImageNoImage 1DNA

2、与基因与基因DNA由脱氧核糖、磷酸及碱由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构苷酸，形成双螺旋结构。 遗传学基础遗传学基础NoImageNoImage 基因（基因（gene）：）：DNA分子中最小的完整功分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者能单位，是生物遗传信息的携带者基因组（基因组（genome）：细胞或生物体的一套）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质完整单体的遗传物质NoImageNoImageNoImage 2、染色质与染色体、染色质与染色体 在间期细胞的细胞核中，通在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着过光镜

3、可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。色的物质，即染色质。 它由它由DNA、组蛋白、非组蛋、组蛋白、非组蛋白及少量的白及少量的RNA组成，形似串珠组成，形似串珠状的复合体。状的复合体。NoImageNoImageNoImage在间期细胞核中，一般没有在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体，故染色质与染叠成染色体，故染色质与染色体是由相同物质组成的；色体是由相同物质组成的； 染色体存在于细胞中，通常染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。染色才能清楚

4、地看到。NoImageNoImage2009-6-30 NoImage染色体可以在显微镜下看到。染色体可以在显微镜下看到。 染色体成对存在，基因也成对存染色体成对存在，基因也成对存在。在。 个体中成对的基因一个来自母本，个体中成对的基因一个来自母本，另一个来自父本。另一个来自父本。 不同对基因形成配子时的分离与不同对基因形成配子时的分离与不同对染色体在减数分裂期的分离，不同对染色体在减数分裂期的分离，都是独立分配的。都是独立分配的。NoImageNoImageNoImage3、基因型与表型、基因型与表型 基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的

5、遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。 表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。表现。 外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。NoImageNoImageNoImage细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。终了所经历的过程。 G0 ：DNA合成前期；合成前期； G1 ：DNA合成期；合成期； S：完成：完成DNA复制；复制； G2：为有丝分裂做准

6、备；：为有丝分裂做准备； M：有丝分裂期：有丝分裂期 4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂、细胞周期、有丝分裂与减数分裂 NoImageNoImage 有丝分裂过程有丝分裂过程NoImage有丝分裂指细胞核分有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的亲代细胞完全相同的染色体。染色体。NoImageNoImageNoImage减数分裂过程减数分裂过程NoImageNoImageNoImageNoImage生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续

7、，这个过程称为命的延续，这个过程称为遗传遗传。 遗传的稳定是相对的。遗传的稳定是相对的。 在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为这种差异称为变异。变异。一、基本概念一、基本概念NoImageNoImageNoImage造成生物变异的原因有：造成生物变异的原因有： 亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生； 由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；来源；由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。生。NoImageN

8、oImageNoImage自发突变自发突变 (spontaneous mutation) 是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。发生的突变。 特点：自发突变的发生过程长，频率极低特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种与物种的进化有关。的进化有关。诱发突变诱发突变 (induced mutation) 是指人为的造成突变是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。园艺学家利用来培育和选择新种或良种。 特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也特点：发生过程短，

9、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。可能对人类产生危害。遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生新的表型效应称为突变。新的表型效应称为突变。NoImageNoImage突变的分类突变的分类v基因突变基因突变 (gene mutation)：一个或几个一个或几个DNA 碱基碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。发育、生化、形态等表型改变来判断。v染色体畸变染色体畸变 (chromosome aberration)：染色体的结染色体的结构及数目改变，可用光学

10、显微镜进行观察。构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 染色体结构改变染色体结构改变 染色体数目改变染色体数目改变NoImageNoImageNoImage二、突变类型二、突变类型遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变基因突变 染色体畸变染色体畸变NoImageNoImage基因突变基因突变一个或几个一个或几个DNADNA碱基对的改变。碱基对的改变。 染色体畸变染色体畸变染色体的结构及数目改变。染色体的结构及数目改变。 端粒端粒姊姊妹妹染染色色单单体体着丝粒着丝粒组组 蛋蛋 白白双双 螺螺 旋旋碱基对碱基对端粒端粒NoImageNoImageNoIm

11、age这些损伤多因这些损伤多因DNA受损所致，也可能因受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所致。以外的靶组织受损所致。 基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。质是相同的，其区别在于受损程度。NoImageNoImageNoImage通常以光学显微镜的分辨率通常以光学显微镜的分辨率0.2 m来区来区分基因突变和染色体畸变。分基因突变和染色体畸变。 基因突变是用光学显微镜观察不到的，基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微变来

12、判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。镜进行观察。NoImageNoImage1. 基因突变基因突变基因突变指基因中基因突变指基因中DNA序列的变化。序列的变化。 因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。NoImageNoImage碱基置换碱基置换 指指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对

13、，复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。最终产生碱基对置换或简称碱基置换。 NoImageNoImageNoImageNoImage移码突变移码突变 移码是移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。的倍数的碱基对所造成的突变。NoImageNoImage整码突变整码突变 指在指在DNA中增加或减少的碱基对为一中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。个或几个密码子。片断突变片断突变 指基因中某些小片断核苷酸序列发生指基因中某些小片断

14、核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。排。NoImageNoImage2. 染色体畸变染色体畸变指染色体的指染色体的结构异常和数目异常结构异常和数目异常，它是，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。体来发现。NoImageNoImageNoImage（1）染色体结构异常）染色体结构异常 有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些有些畸变是稳定的，可通过重

15、复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。可在机体或细胞群传递。NoImageNoImage容易观察到的畸变有容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位易位。NoImageNoImage染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙(gap) 断裂断裂(break) 断片断片(fragment)和缺失和缺失(deletion) 微小体微小体(m

16、inute body) 无着丝点环无着丝点环环状染色体环状染色体 双着丝点染色体双着丝点染色体 倒位倒位(inversion) 易位易位(translocation) 插入插入(insertion)和重复和重复(duplication) 辐射体辐射体 NoImageNoImage染色体结构变异类型染色体结构变异类型染色体染色体缺失缺失,如果蝇的缺刻翅如果蝇的缺刻翅染色体染色体重复重复,如果蝇的棒状眼如果蝇的棒状眼染色体染色体倒位倒位染色体染色体易位易位, 如夜来香的变异如夜来香的变异 NoImageNoImage在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的在染色体上出现无染色质的区域，但该区域

17、两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。染色体仍保持线状连接者为裂隙。 指染色体上指染色体上狭窄的非染色带，狭窄的非染色带，无线状连接者为无线状连接者为断裂。带宽超过断裂。带宽超过染色单体宽度。染色单体宽度。裂隙裂隙（gap）和）和断裂断裂（break）NoImageNoImage一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。失和中间缺失。无着丝粒断片无着丝粒断片（fr

18、agment）、）、缺失缺失（deletion）NoImageNoImage染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。状染色体。环状染色体环状染色体（ring chromosome）NoImageNoImage当某一染色体发生两次当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒断裂后，其中间节段倒转转180 再重接，称为再重接，称为 倒倒位。位。倒位倒位（inversion）NoImageNoImage当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的

19、断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。来，称为插入。 如果此时有缺失的染色体和插如果此时有缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。全相同的节段，此时称为重复。插入插入（insertion）和）和重复重复（duplication）NoImageNoImage两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另

20、一染色体上称为易位。节段接到另一染色体上称为易位。易位易位（translocation）NoImageNoImage（2） 染色体数目异常染色体数目异常 整倍性畸变：整倍性畸变：单、三、四、多倍体单、三、四、多倍体 非整倍性畸变：非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少倍体多一条或少一条或多多条或少多条多条 2n-1,2n-2, 2n+1,2n+2, NoImageNoImage类型类型公式公式染色体组染色体组整倍体整倍体单倍体单倍体n(ABCD)二倍体二倍体2n(ABCD) (ABCD)三倍体三倍体3n(ABCD) (ABCD) (ABCD)四倍体四倍体4n(ABCD) (ABCD)

21、(ABCD) (ABCD)非整倍体非整倍体单体单体2n-1(ABCD) (ABC)三体三体 2n+1(ABCD) (ABCD) (A)四体四体2n+2(ABCD) (ABCD) (AA)双三体双三体2n+1+1(ABCD) (ABCD) (AB)缺体缺体2n-2(ABC) (ABC)染色体数目异常的基本类型染色体数目异常的基本类型注：A、B、C、D代表非同源染色体NoImageNoImageDNA修复修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复

22、三、突变的发生与修复机制三、突变的发生与修复机制 外源化学物引起外源化学物引起基因突变和染色基因突变和染色体突变的靶部位体突变的靶部位主要是主要是DNA，而，而导致染色体数目导致染色体数目异常的靶部位主异常的靶部位主要是有丝分裂和要是有丝分裂和减数分裂器，如减数分裂器，如纺锤丝。纺锤丝。NoImageNoImage致突变作用致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。致突变物致突变物：凡能引起生

23、物体遗传物质发生改变的化：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。毒物。四、致突变试验与致突变作用评价四、致突变试验与致突变作用评价NoImageNoImageNoImage观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：进行。主要目的：检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；物和人的致癌性；检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。

24、性，预测其对人体的遗传危害性。NoImageNoImage观察项目的选择观察项目的选择基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为的各种事件统称为遗传学终点遗传学终点(gene

25、tic mdpoint)。NoImageNoImage正常正常DNADNA损伤损伤DNA修复过程修复过程未修复的未修复的DNA损伤表达损伤表达断裂的断裂的DNA分子分子染色体结染色体结构异常构异常基因基因突变突变细胞细胞死亡死亡 非整倍体非整倍体 多倍体多倍体重组事件重组事件 SCE 有丝分裂性交换有丝分裂性交换染色体分染色体分离异常离异常细胞屏障细胞屏障遗传毒物遗传毒物无误无误修复修复易错易错修复修复细胞分裂细胞分裂突变发生中的事件及遗传学终点的关系突变发生中的事件及遗传学终点的关系NoImageNoImageNoImage常用的致突变试验常用的致突变试验1、细菌回复突变试验、细菌回复突变试

26、验（Ames试验）试验） 2、哺乳动物细胞基因突变、哺乳动物细胞基因突变试验试验3、果蝇伴性隐性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验4、染色体畸变分析、染色体畸变分析 5、微核试验、微核试验 6、姐妹染色单体交换试验、姐妹染色单体交换试验 7、显性致死试验、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验、小鼠可遗传易位试验9、细菌、细菌DNA修复试验修复试验10、程序外、程序外DNA合成实验合成实验11、精子畸形试验、精子畸形试验12、小鼠特异基因座试验、小鼠特异基因座试验NoImageNoImageNoImageNoImageNoImage致突变试验组合的原则致突变试验组合的原则一组可靠的试验系统应包括每一

27、类型的遗传学终点。一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。型遗传学终点。体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。细胞、低等和高等真核细胞，这样更加

28、具有说服力。NoImageNoImage以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。试物引起其回复突变的作用。 试验菌株：试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌Ames试验试验 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌回复试验大肠杆菌回复试验 1、细菌回复突变试验、细菌回复突变试验NoImageNoImageAmes试验原理：试验原理： 检测受试物诱发检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型回复突变成野生型(his+)的能力。的能力。 试验菌株都有组氨酸突变试验菌株都有组氨酸

29、突变(his-)，不能自行，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平板上不能生长。板上不能生长。NoImageNoImage鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺陷型组氨酸营养缺陷型突变株突变株(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物NoImageNoImage有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。NoImageNoImagevAmes试验

30、标准试验菌株有四种：试验标准试验菌株有四种：TA97和和TA98检检测移码突变，测移码突变，TA100检测碱基置换突变，检测碱基置换突变，TA102对对醛、过氧化物和醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。交联剂较敏感。v这四个试验菌株除了含有这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附突变，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。加突变，检测时提高试验敏感性。vAmes试验的方法有平板掺入法，点试法及预培试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。养法等。NoImageNoImage 突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型成野生型(his

31、+) ，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落。平板上生长成可见菌落。 如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。致突变物。NoImageNoImage结果判断v只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。致突变物。v仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。突变物。v不加不加S9混合液

32、得到阳性结果，说明受试物是直接致混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。突变物。v加加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。突变物。NoImageNoImage哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。养细胞的基因正向突变试验。 常用细胞株常用细胞株 选用的基因座选用的基因座 小鼠淋巴瘤细胞（小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y ） TK、HPRT 中国仓鼠卵巢组织细胞（中国仓鼠卵巢组织细胞（CHO） HPRT 中国仓鼠肺组织细胞（中国仓鼠肺组织细胞（V79） HPR

33、T 人淋巴细胞人淋巴细胞 HPRT 2. 哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay)NoImageNoImageTK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷ATP 胸苷酸。胸苷酸。 存在嘧啶类似物存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。异常核苷酸使细胞死亡。 受试物存在时若细胞不死亡说明受试物存在时若细胞不死亡说明TK发发生突变。生突变。（1）TK基因座基因座NoImageNoImage次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催

34、化次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖焦磷酸黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷核苷-5-单磷酸（单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的基类似物，生成相应的NMP，掺入到，掺入到DNA中可致死。中可致死。 加入受试物后能存活的细胞表示发生基加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变因突变HPRT-。（2）HPRT基因座基因座NoImageNoImage制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。直接观察染色体的数目和形态的改变。 染染色体畸变试验也常称为色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验细胞遗传学试验(c

35、ytogenetic assay)。 染色体畸变试验可为体外试验，也可为体染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。3. 染色体畸变试验染色体畸变试验NoImageNoImage体内试验体内试验：多观察：多观察骨髓细胞骨髓细胞，其分裂旺，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。的浓度

36、。NoImageNoImage体外试验体外试验：常用：常用中国仓鼠肺细胞中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和和V79等细胞等细胞系系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。原代或早代细胞。 NoImageNoImage2009-6-30 NoImageNoImageNoImage试验步骤v染毒：健康成年染毒：健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24小时予环磷酰胺小时

37、予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。体重腹腔注射。v收获细胞：处死动物前收获细胞：处死动物前24h，秋水仙碱，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸剪去两端骨垢，用注射器吸NS约约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500 r/min离心离心10min，弃上清液。弃上清液。v低渗：打散沉淀物，加入预温低渗：打散沉淀物，加入预温37的的 0.075 mol/L KCl约

38、约6ml，混匀，于混匀，于37低渗低渗1520min，再加固定液，再加固定液 l2 ml混匀，立即以混匀，立即以1000r/min离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。NoImageNoImagev 固定：重悬细胞，加入固定液固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温混匀，放置室温1020min，然后然后1000r/min离心离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约弃上清液，留约0.5ml。v 制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片载波片1015Cm高处滴片，干燥，

39、用高处滴片，干燥，用10Giemesa染色液染染色液染色色1020min，轻微冲洗，自然晾干。，轻微冲洗，自然晾干。v 阅片计数。阅片计数。NoImageNoImagev染色体数目改变包括：染色体数目改变包括：整倍体变异：原先整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如的染色体变为多倍体如3n或或4n等。等。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。v染色体结构改变包括：裂隙染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂、断裂(B)、碎片、碎片(F)、环、环形形(r)、交换、交换(E)以及复合性断裂等。以及复合性断裂等。v小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着

40、丝点型。小鼠的染小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为色体数为40条，大鼠的染色体数为条，大鼠的染色体数为42条。条。v读片时每张标本片至少要分析读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。个中期分裂细胞。NoImageNoImage%100%分析染色体的细胞数有染色体畸变细胞数）细胞畸变率（%100%分析染色体的总数染色体畸变总数）染色体畸变率（NoImageNoImage染色体的断片或迟滞的染色体染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与

41、细胞形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致主核着色一致，圆，圆形或椭圆形。形或椭圆形。4、微核（、微核（micronucleus）试验）试验NoImageNoImageNoImageNoImage无核细胞无核细胞红细胞红细胞有核细胞中有核细胞中微核难与正常核分叶微核难与正常核分叶及核突出物区别及核突出物区别微微核核试试验验NoImageNoImage常用啮齿类动物常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞骨髓嗜多染红细胞(PCE)或或外周血细胞外周血细胞进行微核试验。进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，胞的主核已排出，微核容易

42、辩认，PCE胞胞质含质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后一般采用多次染毒后24 h采样。采样。NoImageNoImage红细胞的分化成熟过程NoImageNoImageNoImageNoImageNoImageNoImageMNNCEIllustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus (arrow). Nuclear material appears in yellow, cytoplasm in r

43、ed. Acridin-Orange staining, fluorescence microscopy, enlargement 1000 fold NoImageNoImage试验步骤试验步骤v健康成年健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24 h予环磷酰胺予环磷酰胺40 mg/kg腹腹腔注射染毒。腔注射染毒。v小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨双侧后肢股骨，纱布擦去多余，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打

44、骨髓团块混匀。髓团块混匀。v以以 1000r/min速度离心速度离心 10 min，弃上清液，留下约，弃上清液，留下约0.5 ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。沉淀物混匀后，滴片两张，推片。v将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾，取出晾干。干。v将固定晾干后的骨髓片，用将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色应用液染色1015min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。干。v显微镜观察并计数微核率。显微镜观察并计数微核率。NoImageNoImagev PCE呈灰蓝色，成熟呈灰蓝色，成熟RBC呈粉

45、红色，呈粉红色，NC呈蓝紫色。呈蓝紫色。v PCE中含有的微核大小为细胞直径的中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数计数1000个个PCE中含微核的中含微核的PCE数。数。 微核率（微核率（）= =含微核含微核PCEPCE细胞数细胞数PCEPCE细胞总数细胞总数1000NoImageNoImageGiemsa染色染色vPCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为

46、圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色vNCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。NCE PCE & MCNNoImageNoImage结果分析与评价结果分析与评价v本试验中只计数本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。中微核，微核率以千分率表示。vPCE/NCE为评价细胞毒性的指标：为评价细胞毒性的指标：F正常正常PCE/NCE比值约为比值约为l（正常范围为（正常范围为0.61.2）；）；F如如PCE/NCE0.1，则表示，则表示PCE形成受到严重形成受到严重抑制；抑制；F如如PCE/NCE0.05，则表示受试化学毒物的剂，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。量过大，试验结果

47、不可靠。NoImageNoImage77结果示小鼠骨髓嗜多染红细示小鼠骨髓嗜多染红细胞中一个微核（胞中一个微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞（染红细胞（NCE）NoImageNoImage78示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核（示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核（MN）NoImageNoImage79示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核（示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核（MN）NoImageNoImage 显性致死指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学显性致死指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。一般认为显一般认为显

48、性致死主要是由于染色体损伤的结果。性致死主要是由于染色体损伤的结果。显性致死试验显性致死试验以以胚胎死亡胚胎死亡为观察终点，为观察终点，用于检测受试物对动物性细用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。胞的染色体损伤作用。 一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。以评价。5. 显性致死试验显性致死试验(dominant lethal assay)NoImageNoImage6. 程序外程序外DNA合成试合成试验验(unscheduled DNA synthesis test，UDS) 当当DNA受损后，受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期的修复合成可发生在正常复制合成期(S期期)以外的其他时期，称为程序外以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将合成。用同步培养将细胞阻断于细胞阻断于Gl期，并将正常的期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有受试物处理细胞，并在加