生物学实验之凝胶回收基础及操作

1、生物学实验之凝胶回收基础及操作 胶回收基础知识一一目 录2 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二 胶回收基础知识一一目 录3 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二1.胶回收的概念2.胶回收的原理1.1 胶回收概念从电泳后的凝胶中回收目的DNA的过程，其目的是将目标DNA重新利用。Lane M:1kb DNA MarkerLane 1:胶回收前的2.7kb DNA段Lane 2:胶回收后的2.7kb DNA段切割Lane 1后，经处理回收DNA，经电泳得到Lane 2。切割回收41.2 胶回收原理利用核酸在裂解液下与硅胶膜吸附柱特异性结

2、合，在洗脱液条件下被洗脱，从而达到核酸纯化回收的目的。电泳后 ，切下凝胶称重后，加入等体积溶胶液上柱吸附DNA除胶脱盐洗脱5 胶回收基础知识一一目 录6 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二1.分类2.应用2.1 分类1硅胶柱法2玻璃奶/纯化填料法3低熔点琼脂糖法4透析带电洗脱法5DEAE纤维素膜纸片法72.1.1 硅胶柱法采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从凝胶中回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂质。最简单快速的回收方法。不适合用于大片断的回收。82.1.2 玻璃奶/纯化填料法利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性

3、，根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收。玻璃奶/纯化填料法92.1.3 低熔点琼脂糖法传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现已较少使用。102.1.4 透析带电洗脱法切下的条带放在充满TAE的透析带中电泳，让 DNA跑出凝胶，跑向溶液中，再通过反向电泳，将附在透析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀。再次电泳后的胶

4、通常还要再染色看看残留。由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时才会考虑的。丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。112.1.5 DEAE纤维素膜纸片法将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE 纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65保温洗脱，直到膜上DNA被完全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 早期实验室最常用方法之一。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。122.2 应用13 胶回收基础知识一一目 录14 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二

5、1.试剂2.耗材3.设备3.1 试剂产品组成产品组成平衡液BL（Buffer BL）溶胶液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脱缓冲液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)153.2 耗材各种规格移液枪、枪头 离心管163.3 设备离心机17 水浴锅3.3 设备凝胶成像系统 水平电泳仪18 胶回收基础知识一一目 录19 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二1.实验流程2.注意事项4.1 实验流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 1200

6、0rpm,离心1min2 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3204.1 实验流程 将目的条带从琼脂糖凝胶中切下1放入干净的离心管中2 称取重量3214.1 实验流程向胶块中加入等体积溶液PN1 50水浴，不断温和地上下翻转离心管，确保胶块充分溶胶。2224.1 实验流程 将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中，室温放置2min1 12000rpm,离心3060sec2 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3234.1 实验流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,离心3060sec2 弃废液，将吸附 柱重新放回收集管中。重复操作1,2,33244.1 实验流程 将吸附柱CA2放回收集

7、管中1 12000rpm,离心2min2 将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，晾干3254.1 实验流程 将吸附柱CA2放到一个干净离心管中1 向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min2 12000rpm,离心2min收集DNA溶液326原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。4.1 实验流程27不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围琼脂糖浓度（）DNA有效分离范围（Kb）0.53010.7120.81.0100.51.270.41.530.24.1 实验流程28在锥形瓶中加入1mL 50 xT

8、AE 、49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷却至不烫手；加入2.5LNuclleic Acid Stain核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝固。琼脂糖凝胶制作上样电泳取1L上样缓冲 液 与5 L产物混匀垂 直 加 入 上 样孔中。电泳条件：140V，20min。4.1 实验流程294.2 结果分析琼脂糖凝胶电泳将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像 系统中拍照保存。对结果进行分析：看有无目的带看是否存在非特异带看条带亮度切割回收304.2 注意事项1.洗脱体积不应小于30L，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。

9、若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.08.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。314.2 注意事项2.平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。使用前请先检查平衡液BL是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。324.2 注意事项3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。4.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加1030L3M醋酸钠（pH5

10、.2)将pH值调制57之间。334.2 注意事项.切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。7.回收10kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。8.回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。34 胶回收基础知识一一目 录35 试剂耗材与设备三三 操作流程四四 常见问题解答五五 方法及应用二二5 常见问题解答3636问题问题可能原因可能原因 用胶回收试剂 盒从凝胶中回 收DNA得率低 是什么原因？ 胶溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例 胶体积太大，可用枪头捣碎，若不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回

11、收 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制 在30s以内 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率 TAE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致pH值升高，降低DNA和膜的吸 附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好 回收前的样品量太少，加大点样量 洗脱前，预先65预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可 以有效提高回收率30%以上5 常见问题解答37问题解决方法加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切

12、为小碎块，分几次回收水浴温度是否达到规定温度65，用温度计检测琼脂糖凝胶块不溶？琼脂糖质量不好含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 或-20制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧38胶回收标准实验流程试剂耗材与设备试剂产品组成试剂产品组成平衡液BL（Buffer BL）溶胶液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脱缓冲液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)耗材耗材移液枪枪头离心管设备设备凝胶成像系统离心机水浴锅水平电泳仪39胶回收标

13、准实验流程实验流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 12000rpm,离心1min2 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3 将目的条带从琼脂糖凝胶中切下1放入干净的离心管中2 称取重量340胶回收标准实验流程实验流程向胶块中加入等体积溶液PN1 50水浴，不断温和地上下翻转离心管，确保胶块充分溶胶。2 将所得溶液加入 一个吸附柱CA2中，室温放置2min1 12000rpm,离心3060sec2 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中341胶回收标准实验流程实验流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,离心3060sec2 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复操作1,2,33 将吸附柱CA2放回收集管中1 12000rpm,离心2min2 将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，晾干342胶回收标准实验流程实验流程 将吸附柱CA2放到一个干净离心管中1 向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min2 12